1、1,临床药理研究所,细胞分离与培养技术,2,现代生物技术,基因工程技术,细胞工程技术,酶工程技术,发酵工程技术,细胞培养,细胞分离技术,从血液、体液中分离细胞从原代组织中分离细胞从原培养容器中分离细胞 - 传代培养,3,原代培养,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,采血方法：人 静脉穿刺、耳垂或手指针刺采血；小动物（大鼠、小鼠） 剪尾法、眼眶采血、心脏穿刺法、断颈取血或股动脉放血。兔 耳静脉或动脉穿刺取血。,4,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,血液抗凝方法：肝素法：按每ml血液约用0.1-0.2mg肝素（即5%肝素溶液2-4l）；草酸盐法：取草酸钾0.2g，草酸铵0.3g，加双蒸水10
2、ml溶解后，取0.2ml放入5ml的试管中，使其干燥。若采用5ml以下的血液可直接注入此试管中，轻轻摇晃；枸橼酸钠法：先配制2%枸橼酸钠，取0.15-0.2ml加于1ml血液中即可抗凝；EDTA法（186.1）：每ml血液中加0.5mmol/L EDTA 2l。,5,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,体液标本采集： 在局部70%酒精消毒灭菌后，用灭菌注射器穿刺入体腔（如胸腔，腹腔，关节腔等）抽取液体样品。,6,膝关节腔穿刺,胸腔穿刺,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,血样中红细胞和白细胞的分离： 利用细胞的相对密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉降法结合不同速度的离心沉降法将不
3、同的细胞分离。 抗凝血，室温或37下直立静置30-60min，红细胞沉降至下层，中间乳白色薄膜层为白细胞及血小板，上层为淡黄色血浆。也可将抗凝血与3%明胶（经灭菌消毒）等量或3l量混合于离心管中，直立静置30-60min，红细胞沉于管底，上层乳白色混浊液含白细胞。,7,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,8,血中单个核细胞的分离： 单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其相对密度在1.050-1.077之间，采用速度沉降法原理使其分离。 淋巴细胞分离液,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,血中单核细胞的分离： 利用细胞在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离,9,单个核细胞悬液,多将悬液放入
4、12cm直径的培养皿中，于37培养箱中静置30-60min。此时单核细胞贴壁，而淋巴细胞尚未贴壁，倾出未贴壁细胞，并用Hanks液轻轻冲洗培养皿以尽量洗下未贴壁细胞（淋巴细胞）。,用Hanks液强力冲洗吹打与震荡，将贴壁的单核细胞冲落或用刮刀轻刮，收集贴壁的单核细胞。,计数后分别制备所需浓度的细胞悬液。,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,黏附法分离血中单核细胞、T，B淋巴细胞,10,因B淋巴细胞和单核细胞能黏附于尼龙纤维柱上（聚酰胺纤维柱），所以可将其与T淋巴细胞分离。,具体步骤：单个核细胞用含20%小牛血清RPMI-1640制成（2.5-3）107/ml的细胞悬液。先用Hanks液，再用
5、含20%小牛血清的RPMI-1640液冲洗平衡尼龙纤维柱，冲洗液尽量流净。将尼龙柱预温37，再用配制的单个核细胞悬液2ml装入尼龙纤维柱，不使流出，37温箱内静置l小时。取下注射针头，用预温37含20%小牛血清的RPM I-1640培养液冲洗尼龙纤维柱，洗出者即为未黏附的T淋巴细胞。从注射器内取出尼龙纤维，在4的RPMI-1640液内漂洗，并轻轻挤压，将黏附的B细胞洗脱收集（B淋巴细胞中混有的单核细胞可用贴壁法将其分离）。收集的T、B淋巴细胞可分别用Hanks液悬浮，洗涤，离心（250g，7min），并重复洗涤3次。计算活细胞，计数悬液中的细胞数后制备所需浓度的T和B淋巴细胞悬液。,11,细胞
6、分离技术-从血液、体液中分离细胞,免疫磁珠法(MACS)分离T、B淋巴细胞： 磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。,12,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,免疫磁性微珠用于细胞的分离和纯化的基本原理及步骤是：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的
7、目的。 通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以分离。,13,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,免疫磁珠分离细胞已被广泛应用于人类各种细胞的分离，如T(CD3)、B(CD19)淋巴细胞、内皮细胞(CD34)、造血祖细胞(CD34)、单核/巨噬细胞(CD14)、胰岛细胞(胰岛GK和GLUT2（葡萄糖转运子）) 、多种肿瘤细胞等。,14,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,15,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,16,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,17,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,MA
8、CS技术优点：稳定、高质量的分选：纯度（90-99%）对细胞无损伤操作简便、快速：消毒方便，手动分选30分钟内完成，autoMACS分选2.5-10分钟之内完成。从实验室到临床：MACS技术可以实现105-1011个细胞分选。有autoMACS和CliniMACS。分选后细胞适用于后续实验：分选后适用于细胞培养和体内实验，分选得到的标记和未标记细胞组分均可回收利用。从细胞到分子分选：不仅可以分选各种细胞，还可以分选转染细胞、亚细胞物质、蛋白质、DNA、RNA及mRNA。,18,MACS技术缺点：分离效率较流式细胞仪分选略低且耗材相对较贵，适合无大型流式细胞仪设备且对分选细胞纯度要求不高的分选。
9、只适用于简单标记的细胞分离,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,流式细胞术分离法分离T、B淋巴细胞：密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成1107 /ml； 加适量FITC-抗CD3或FITC-抗CD19，4孵育30min, 用RPMI-1640培养基洗2次；用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。,19,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,注意事项：分选细胞常用于细胞亚群进一步的功能研究，因此，整个过程均需要严格无菌操作，流式细胞仪进行无菌冲洗。此法分离得到的T细胞纯度可达到99%,收获率可达到90%。由于
10、喷嘴孔很小（约70100m），分选前用3040m孔径的滤网过滤细胞悬液，以免堵塞喷嘴。,20,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,优缺点：流式细胞仪分选纯度较高、回收率高，分选一些具有比较复杂细胞标记的细胞时相当有用的，例如要分选出白血病人骨髓中某些 CD34+CD13-CD45dim的幼稚细胞，只需要在流式上简单地逻辑设门就可以了，而且流式可以双通道分选，也就是同一时间分选出两种细胞，流式分选成本比磁珠低。流式分选最致命的缺点就是污染，且设备昂贵，技术复杂，需专业技术人员操作，操作费时，适合对细胞纯度和回收率要求较高的分选。,21,细胞分离技术,二、从原代组织中分离细胞组织和器官采集：人标
11、本：可采取无菌手术法切取少量所需的组织或器官（活检和手术）。大量的动物组织：先麻醉或处死，浸入70%酒精中，使毛皮全部浸湿，从腹中线剪开皮肤，注意不要剪开胸腔或腹腔。将皮肤向上、下撕开分离并向上、下翻开，暴露胸腹部的筋膜，用生理盐水洗净黏于筋膜上的断毛，以碘酒和70%酒精消毒后，更换一套消毒灭菌的器械，剪开胸腔或腹腔，无菌采取所需器官。动物的骨髓：可以无菌手术采取一段股骨，用灭菌注射器，将小牛血清或培养液从断端一端加压注射以从另一断端出骨髓。,22,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,制备细胞悬液方法：将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂
12、解离细胞法。从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短，以保持最大的活性。包括胰蛋白酶、胶原酶和中性蛋白酶等。,23,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,1.胰蛋白酶 (Trypsin),24,在去除不需要的组织后，使用无钙镁的平衡盐溶液清洗组织块，重复清洗2到3次。用无菌的解剖刀和剪子把组织切成1-2mm3小块。,将盛有组织碎片的容器置于冰上。加入0.25溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml 胰蛋白酶）。,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,25,在4孵育6到18小时，使胰蛋白酶尽可能渗透进去,移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37孵育
13、包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟,在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂,通过无菌不锈钢丝网（100-200目）过滤，计数和接种细胞，进行培养,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,2. 胶原酶 (Collagenase),26,用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成1-2mm3小块，用Hanks平衡液（HBSS）清洗组织碎片几次,加入胶原酶（50200单位/ml，溶解在HBSS中）,在37孵育4到18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,27,通过离心在HBSS中清洗悬液几次,再一次在培养基
14、中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养,通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,3.中性蛋白酶(Dispase),28,用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成1-2mm3小块，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次,加入Dispase（0.62.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液）,在37孵育20分钟到几个小时。,细胞分离技术,29,通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase,通过离心在平衡盐溶液中清
15、洗悬液几次,再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,举例（滑膜细胞的胶原酶胰蛋白酶消化分离法 ）:,30,无菌取滑膜组织，去除脂肪、纤维等,用D-Hanks液（无Ca2+、Mg2+，含青霉素200kUL-1、链霉素200mgL-1）反复冲洗后剪成12mm3小块，离心洗涤2 次,置于加入2ml含10%胎牛血清、0.4%型胶原酶的DMEM培养液的培养瓶中，在37、5%CO2培养箱中消化2h，每隔10min吹打1 次。,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,31,再加入含0.25%胰蛋白酶的D-Hanks液4ml，培养消化30min,将培养液移至离心管中
16、，1200rpm离心10min，弃上清,200目尼龙网纱过滤，1200 rpm离心10min，弃上清,将获得的细胞在37、5%CO2培养箱中培养24h，弃去未黏附细胞（如淋巴细胞，红细胞），此时的贴壁细胞即为原代滑膜细胞,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,4.组织块培养法举例（成纤维样滑膜细胞组织块培养法）：,32,无菌取滑膜组织，去除脂肪、纤维等，用不含钙镁的D-Hanks液（含青霉素200kUL-1、链霉素200mgL-1）反复冲洗后剪成12mm3小块,用吸管吸取均匀排列于培养瓶（预先用含20胎牛血清DMEM培养液湿润）的底壁，瓶底朝上，37、5%CO2培养箱中培养3h，使其贴壁,细胞分
17、离技术-从原代组织中分离细胞,33,待细胞快长满时用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代培养，取第35代细胞用于实验,观察到有大量成纤维细胞长出后轻轻去除组织块，继续培养,轻轻翻转培养瓶，使培养液刚刚覆盖组织块，每隔23天换一次培养液,成纤维样滑膜细胞组织块培养法,34,培养24h,培养96h,培养120h,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,举例（初步淋巴细胞分离法）：,35,放血处死动物，无菌取胸腺和脾组织，去除脂肪和结缔组织，放入盛有含5%小牛血清的D-Hanks液（不含钙镁，含青霉素200kUL-1、链霉素200mgL-1）平皿的网纱中（200目）,用注射器针芯轻轻碾碎胸腺和脾组织，使单个
18、细胞经网进入溶液中,溶液移入离心管中， 1200 rpm离心10min，弃上清， D-Hanks液洗涤细胞，加入DMEM培养液计数和调节细胞浓度，进行培养,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,举例（乳鼠原代心肌细胞培养法）：基本原理： 心肌细胞培养方法有离体心脏灌注法、酶消化法和组织块法，将心肌组织分离成单个细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，在体外适宜条件下使之生长繁殖，并保留其结构与功能特性。,36,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,评价：离体心脏灌注法对乳大鼠来说实施难度大;酶消化法操作流程长，细胞对消化酶浓度及作用时间要求严格，但是能得到大量单细胞；组织块法操作简单，实验成本低，可得到具
19、较高纯度的心肌细胞。因此，心肌细胞原代培养常用的方法多用酶消化法和组织块法两种。,37,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,心肌细胞的酶消化培养法：1.心肌组织的选择： 生后14天的Wistar乳鼠心脏等。2.心肌组织块的制备： 乳鼠用75%乙醇/1%新洁尔灭消毒皮肤，无菌开胸，暴露心脏，于心脏收缩期剪下心脏，置于盛D-Hanks 液的培养皿中，剪开心脏，清洗三次，以去除血污。,38,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,3.心肌细胞悬液的制备： 取心尖部组织（心室）剪为1mm3碎块，在大离心管中放入组织碎块，加入0.06% 0.25%的胰蛋白酶溶液815ml，在磁力搅拌器上，37水浴消化10m
20、in，自然沉淀后弃上清。剩余组织块中再加入新胰蛋白酶， 消化10min，静置后将上清液移入盛有15%新生牛血清培养液的离心管中终止消化，并以1000rpm离心10min，弃上清，用培养液充分吹打成单细胞悬液。剩余沉淀用同样条件及方法反复消化，直至将组织基本完全消化为止，分次收获心肌细胞。,39,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,4.心肌细胞悬液的接种： 将分次收获的心肌细胞用Hanks 液离心清洗12 次，弃上清液。将沉淀细胞定量加入培养基35 mL，吹打混匀，制成细胞悬液。应用白细胞计数板计数细胞，调整至所需浓度，37 、5 % CO2 培养箱培养。5.细胞纯化： 培养2 h，将细胞悬液进
21、行换瓶培养，去除瓶底的贴壁细胞；2 h 后，去除瓶底的贴壁细胞，重复一次，方法同前，以去除成纤维细胞，纯化心肌细胞。,40,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,心肌细胞的贴块培养法： 1.取材：按前述方法取出心脏，置于盛Hanks 液的培养皿中，清洗三次。 2.贴块：将心脏剪为1mm3大小的小块，移入培养瓶底面，用无菌牙科探针将其均匀铺开。 3.干固：盖上瓶盖，37 烤箱培养瓶翻转干固11.5 h。 4.接种培养：添加少量培养基，以恰好盖住组织块为佳，次日加足培养液。,41,42,细胞分离技术,三、从原培养容器中分离细胞（传代培养） 贴壁细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中
22、的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。,43,细胞分离技术-传代培养,对于贴壁不太紧的细胞如人胚胎肾（HEK）293细胞等，可以直接吹散后分瓶; 对于贴壁较紧的细胞如中华仓鼠卵巢（CHO）细胞、滑膜细胞（Synoviocytes）等，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶（以下操作均按无菌操作的要求进行）：,44,细胞分离技术-传代培养,45,将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去,加入0.25胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使充分浸润,一般消化时间约为1-3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并
23、加入适量的细胞培养液终止消化 ，也可以在显微镜下观察细胞是否变圆,视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例,细胞分离技术-传代培养,胰酶消化的程度是一个关键： 消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。,46,细胞分离技术-传代培养,影响消化速度的因素： 主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等。消化程度以轻吹或加培养液后轻摇可下为好。下面将细胞生长及不同消化程度的光学显微镜照片列出以供参考（以CHO细胞为例）。,47,48,复苏后细胞,培养24h,培养48h,刚加胰酶,开始皱缩,明显皱缩,基本变圆,完全变圆,
