1、 本科毕业论文 （ 20 届） 香水 百合黄酮三种萃取液的抑菌活性研究 所在学院 专业班级 食品质量与安全 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 - 2 - 目 录 摘要 . 1 ABSTRACT . 2 引言 . 3 1 试验仪器与材料 . 4 1.1 供试菌种 . 4 1.2 主要试剂 . 4 1.3 主要仪器 . 4 2 试验方法 . 4 2.1 培养基的制作 . 5 2.2 菌种活化 . 5 2.3 菌落计数 8. 5 2.4 抑菌活性试验 9. 6 2.4.1 菌悬液的制备 . 6 2.4.2 牛津杯法 . 6 2.4.3 最低抑菌浓度 . 6 3 结果与分析 . 7 3
2、.1 抑菌活性 . 7 3.1.1 抑菌圈 . 7 3.1.2 最低抑菌浓度 . 10 4 结论 . 14 参考文献 . 15 致谢 . 16 1 摘要 主要研究香水百合中总黄酮化合物经萃取后得到的三种萃取液的体外抑菌活性。先采用乙醇提取法对香水百合的总黄酮进行提取，再依次以乙醚 、 乙酸乙酯和正丁醇对百合黄酮进行萃取 ， 并以大肠埃希菌 、 沙门氏 菌 、枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌为供试菌 ， 采用牛津杯法 和 最低抑菌浓度（ MIC）法测定 三种 萃取液的体外抑菌活性。试验结果表明：百合花中黄酮对四种菌均有抑菌作用，但三种萃取液对每种菌的抑制作用均不相同 。黄酮提取液以乙醚、乙酸乙酯以
3、及正丁醇萃取得到的萃取液的浓度分别为 101.8mg/ml、 128.6mg/ml 和 687mg/ml，其中 乙醚萃取液对大肠埃希菌 、 沙门氏菌 、 枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径依次为 1.35cm、 0.90cm、 1.05cm、1.25cm，乙酸乙酯萃取液对四种菌抑菌圈直径依次为 0.90cm、 0.90cm、 1.00cm、 1.15cm，正丁醇萃取液分别为 1.25cm、 1.20cm、 1.50cm、 1.35cm。由此可以看出，乙醚萃取液对大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌抑制作用较强，而乙酸乙酯萃取液对四种菌抑制作用均不太明显，正丁醇萃取液对四种菌抑制作用都较为明显，其中枯
4、草芽孢杆菌最为突出。对乙醚萃取液 ， 四种菌的 MIC 值 均为 12.725 mg/ml，对 乙酸乙酯萃取液 ， 金黄色葡萄球菌的 MIC 值为 8.0375 mg/ml， 其余三种菌 均为 16.075 mg/ml，对正丁醇萃取液，大肠埃希菌和沙门氏菌的 MIC 值为 42.9375/ml mg，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC 值均为 85.875 mg/ml。 关键词： 百合花；黄酮萃取液；最低抑菌浓度；抑菌活性 2 Abstract The antibacterial activities in three kinds of extracts which are obtained
5、 from total flavonoids of lily were studied. The ethanol extract of total flavonoids was extracted successively with ether, ethyl acetate and n-butanol, then taking Escherichia coli, Salmonella, Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus strains as the tested materials, the bacteriostatic activity
6、of three kinds of extracts was measured by the Oxford cup and minimum inhibitory concentration (MIC) measurement. The test results showed that the flavonoids extracts of lily had inhibitory effects on each of the tested materials, but the effects of the three kinds of extracts were different. The co
7、ncentration of extraction liquids which were extracted with ether, ethyl acetate and n-butanol successively were 101.8mg/ml, 128.6mg/ml and 687mg/ml, the bacteriostatic rings of ether extract of Escherichia coli, Salmonella, Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus are 1.35cm, 0.90cm, 1.05cm, 1.2
8、5cm in diameter, the diameters of ethyl acetate extract were 0.90cm, 0.90cm, 1.00cm, 1.15cm, n-butanol extract were 1.25cm, 1.20cm, 1.50cm, 1.35cm. It can be known that the ether extract inhibited Escherichia coli and Bacillus subtilis well, the phenomenon on ethyl acetate extract were not too obvio
9、us, but inhibitory effects of n-butanol extract in four kinds of bacteria are very obvious, the Bacillus subtilis is the most. The minimum inhibitory concentration (MIC) for the ether extract of four kinds of bacteria was 12.725 mg/ml, for the ethyl acetate extract liquid, the MIC of Staphylococcus
10、aureus was 8.0375 mg/ml, the other three strains were 16.075 mg/ml, and for the n-butanol extract, Escherichia coli and Salmonella were 42.9375 ml/mg, Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus were 85.875 mg/ml. Key words: Greenish lily flower; total flavonoids extract; minimum inhibitory concentr
11、ation; antibacterial activity3 引言 香水百合是一种百合科百合属的多年生鳞茎类球根草本植物 ,花色繁多艳丽 ,还有令人愉悦的芳香 ,不仅具有很好的观赏价值 1 ，还具有祛咳生津、补脾益气、清心安神的药用价值，同时还是一种广泛应用的切花材料 2，但目前对于香水百合的研究多集中于其挥发性成分 3,对其中含有的黄酮类化合物及其抑菌活性的研究还较为单薄。 绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，目前已知的黄酮类化合物单体就有八千多种，黄酮化合物是一类重要的天然有机化合物，是植物在长期自然选择过程中产生的一类次生代谢产物 5。许多研究已表明其具有多种生物活性，在抗菌、抗病毒、抗
12、过敏、抗氧化、抗癌、免疫调节等方面均具有显著效果，且无毒无害，对人类的肿瘤、衰老、心血管病等退行性疾病的治疗和预防有重要意义 6。 该类化合物还具有较强的抗氧化性，能清除机体代谢过程产生的多种自由基，而肿瘤、癌症、心脑血管疾病、呼吸系统病变、衰老等疾病都与细胞内自由基的产生和积累有密切关 系。黄酮化合物还具有抗癌杀菌等功效，在抗菌防病等方面起着重要的作用，是一类极具开发前景的化合物 4。黄酮类化合物作为一种天然抗氧化剂，已成为人类膳食中的一种不可或缺的抗氧化营养因子 7 。 本试验对百合花的总黄酮化合物经乙醚、乙酸乙酯、正丁醇三种试剂萃取后对大肠埃希菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌等
13、四种供试菌的抑菌活性进行了初步研究，为进一步探讨该植物的研究价值奠定了基础。4 1 试验仪器与材料 1.1 供试菌种 大肠埃希菌（ Escherichia coli） 金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus） 沙门氏菌（ Salmonella） 枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis） 1.2 主要试剂 琼脂 北京奥博星生物技术有限公司 牛肉膏 北京奥博星生物技术有限公司 蛋白胨 北京奥博星生物技术有限公司 氯化钠 天津市永大化学试剂有限公司 氢氧化钠 天津市恒兴化学试剂制造有限公司 无水乙醇 天津市大茂化学试剂厂 1.3 主要仪器 HH-4 数显恒温水浴锅
14、国华电器有 限公司 电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司 立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司 药品冷藏箱 合肥美的荣事达冰箱有限公司 漩涡混合器 上海琪特分析仪器有限公司 超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司 UV-9100 紫外可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司 恒温培养箱 2 试验方法 5 2.1 培养基的制作 牛肉膏蛋白胨固体培养基（又称营养琼脂培养基）：分别称取牛肉膏 0.3g、蛋白胨 1g、氯化钠 0.5g，溶解于 100ml蒸馏水中，用 1mol/L的 NAOH溶液将 pH值调至 7.2-7.4，再加入 1.5-2.0g 琼脂粉，充分溶解后分装在三角瓶或试管中，用高压
15、蒸汽灭菌锅在0.1MPa 下灭菌 20min 后备用。 牛肉膏蛋白胨液体培养基（又称营养肉汤）：除不加入琼脂粉外，其余步骤与固体培养基相同。 2.2 菌种活化 分别将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌以无菌操作，用接种环接种在牛肉膏蛋白胨培养基斜面上 ，采用 Z 字划线，于 37恒温培养 18h 后，放入 4冰箱中保存备用。为防止枯草芽孢杆菌长出芽孢，其培养时间为 16h。若菌种不纯，可先进行平板划线分离，得到单菌落后再以无菌操作分别接种至斜面。 2.3 菌落计数 8 在装有 50ml 液体培养基的 250ml 三角瓶中，接种一环活化后的供试菌株， 37下摇床培养 16-18h，
16、制得初始菌悬液。 菌悬液的梯度稀释：将初始菌悬液以梯度稀释法分别稀释为 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、10-5 、 10-6、 10-7 等系列稀释菌液，具体操作为：取 0.5ml 初始菌悬液加入装有 4.5ml无菌生理盐水的试管中，用漩涡混合器混匀，制成 10-1稀释菌液，再取 0.5ml 的 10-1稀释菌液于另一管装有 4.5ml 无菌生理盐水的试管中，混匀后制成 10-2稀释菌液，按照上述操作顺序，依次制成一系列的梯度稀释菌液。 涂布平板培养：将营养琼脂进行灭菌后，冷至 50左右，再倒入无菌平板中，冷却凝固后便制成营养琼脂平板。分别取 100 l 的 10-4、 10-
17、5、 10-6、 10-7等梯度的稀释菌液，用移液枪接于相应稀释度标签的平板上，再用无菌玻璃涂布棒 （用酒精棉球擦拭并灼烧灭菌）将菌液均匀涂开，平放于实验台上，等菌液稍干后，将平板倒置于 37恒温培养箱内培养 1618h。每个稀释度做一组平行实验，以无菌水做空白对照。 菌落计数：选择平均菌落数在 30300 之间的稀释度，以菌落个数乘以稀释倍数即6 为菌落数，以 cfu/ml 为单位。 2.4 抑菌活性试验 9 2.4.1 菌悬液的制备 在装有 50ml 液体培养基的 250ml 三角瓶中，接种一环活化后的供试菌株， 37下摇床培养 16-18h，制得初始菌悬液。再将初始菌悬液采用二倍稀释法，
18、分别稀释为原液的二分之一，四分之一以及八分之一，以无菌水为空白，用紫外分光光度计在 600nm波长处分别测得吸光值，与菌落计数结果相对应，分别得出四个供试菌株在 600nm 处吸光值与菌落个数的线性关系，再根据吸光值，将初始菌悬液用无菌生理盐水稀释至107 108cfu/ml，从而制成用于进行抑菌实验的供试菌悬液。 2.4.2 牛津杯 法 将灭好菌的营养琼脂培养基冷 却至 50左右，倒入无菌平板内，凝固后制成营养琼脂平板。用移液枪取 100 l 浓度为 106107cfu/ml 的四种供试菌菌悬液，分别加在对应平板上，用无菌涂布棒涂匀，待菌液干后即为含菌平板，再用无菌镊子在平板上等距离放置 3
19、 个牛津杯，用移液枪分别加入以乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取的的黄酮提取液 200 l，每种菌做一个平行样，以无菌水为空白对照，正立于 37恒温箱中培养 1618h。培养完成后，以直尺测量抑菌圈直径，并求出每种药液对菌株平行试验中抑菌圈的平均值，记录结果。 2.4.3 最低抑菌浓度 最低抑菌浓度 （ MIC）法 11： 制备抗菌药物贮备液，黄酮提取液以乙醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取得到的萃取液的浓度分别为 101.8mg/ml、 128.6mg/ml和 687mg/ml，常温下保存。 取待测菌培养斜面，用接种环接种一环到 50ml 营养肉汤中， 37摇床过夜培养，在 600nm 处测量其紫外吸光度，
20、用无菌营养肉汤调整菌液浓度至 1 108cfu/ml 左右，再以营养肉汤 1:100 稀释，得到浓度约为 1 106cfu/ml 的菌液。 参照 CLSI2009 10，采用微量肉汤稀释法 12进行，取无菌 96 孔板（ 75%乙醇浸 泡7 后紫外灭菌干燥），在第一孔加入 100 l 的营养肉汤，和 100 l 的抗菌药物原液，混匀后从中取出 100 l 与第二孔的 100 l 营养肉汤混匀，再加入第三孔，以此类推，进行二倍稀释。乙醚萃取液终浓度分别为 50.9 mg/ml、 25.45 mg/ml、 12.725 mg/ml、6.3625 mg/ml，乙酸乙酯萃取液为 64.3 mg/ml、
21、 32.15 mg/ml 、 16.075 mg/ml、 8.0375 mg/ml，以及正丁醇萃取液为 343.5 mg/ml、 171.75 mg/ml、 85.875 mg/ml、 42.9375/ml mg。此时每孔中含 100 l 液体，再向每孔均加入 100 l 的菌液，使最终细菌接菌量为 5 105cfu/ml左右。 37恒温箱过夜培养，无细菌生长的最低药物浓度即为 MIC值。每种药液对每种菌平行做三排重复，并在 G 行和 H 行分别做仅含菌液的阳性对照和仅含药液的阴性对照。 3 结果与分析 3.1 抑菌活性 3.1.1 抑菌圈 抑菌圈法又叫扩散法，是利用待测药物在琼脂平板中扩散使
22、其周围的细菌生长受到抑制而形成透明圈，即抑菌圈，根据抑菌圈大小判定待测药物抑菌效价的一种方法，是抑菌试验的经典方法，被广泛使用。 目前抑菌圈研究法中使用最多的主要有 K-B 法（滤纸片法）、牛津杯法和打孔法三种。牛津杯法又称杯碟法，将已灭菌的牛津杯置于试验平板中，往杯中注入一定量的待测样品，培养一段时间后测定抑菌圈大小的一种方法。抑菌圈越大 ， 说明抑制效果越明显 。 经试验表明，百合花中的黄酮的三种萃取液对四种供试菌的抑制作用均不太相同 。抑菌圈实验所用的乙醚、乙酸 乙酯、正丁醇萃取液的浓度分别为 101.8mg/ml、128.6mg/ml 和 687mg/ml，其中 乙醚萃取液对大肠埃希菌
23、 、 沙门氏菌 、 枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径依次为 1.35cm、 0.90cm、 1.05cm、 1.25cm，乙酸乙酯萃取液对四种菌抑菌圈直径依次为 0.90cm、 0.90cm、 1.00cm、 1.15cm，正丁醇萃取液分别为 1.25cm、 1.20cm、 1.50cm、 1.35cm。实验所用牛津杯规格为内直径 6mm，外直径8mm，由此可以看出，乙醚萃取液对大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌抑制作用较强， 对其余两个菌抑制作用不太明显，乙酸乙酯萃取液对四种菌抑制作用均不太明显，但正丁8 醇萃取液对四种菌抑制作用都较为明显，其中枯草芽孢杆菌最为突出。 图 1.正丁醇萃取液抑大肠埃希菌抑菌圈 图 2.乙醚萃取液抑大肠埃希菌抑菌圈 图 3.乙酸乙酯萃取液抑大肠埃希菌抑菌圈
