1、毕业论文 文献综述 化学工程与工艺 复合磁性纳米粒子的 SERS 标记免疫研究 前言部分 近年来，磁性纳米颗粒的研究在各个学科领域都引起了人们的广泛兴趣，如药物的靶向传递 1,核磁共振成像 2, 分离跟催化剂中的应用 3, 数据存储 4等领域。 在已报道的各类。磁性纳米粒子中 , 有关四氧化三铁 (Fe3O4)纳米晶体的 SERS 标记研究尤其受到重视 5-6， 铁氧化物 /金核壳磁性纳米材料主要用来进行生物分子的分离 , 对于使用 SERS方法对其进行生物分子靶向分离效果的检测 , 还需要进行更深入的研究 主体部分 标 记免疫分析的基本原理是将多种示踪物的标记技术与免疫学技术相结合 ,用以定
2、量或示踪极微的生物活性物质。传统的拉曼散射光谱信号较弱 ,作为信息读出手段往往缺乏高灵敏性。表面增强拉曼光谱 (SERS) 可使信号增强 6 10 个数量级 ,如今 ,SERS 已被大量应用于生物医学研究各方面。同时 ,随着纳米粒子合成技术的发展 ,纳米粒子用于生物分子标记已成为研究热点 3。将标记分子与抗体分子发生作用形成 SERS 标记物进行免疫检测。采用种子生长法制备铁氧化物 /金磁性核壳纳米粒子 。 1 磁性纳米粒子的制备方法 1.1 共沉淀法 Lyon J L等 7将 FeCl3 6H2O 和 FeCl2 6H2O 按物质的量之比为 1.8： 1 的比例溶解于水中，然后加入适量的柠檬
3、酸 、 聚乙二醇分别作为配合剂和分散剂，在恒温水浴中滴加NaOH 沉淀剂 。 整个反应过程在氮气的保护下进行，并以 1 500 r/min 速度搅拌 。 其产物经离心分离，乙醇 、 碳酸氢铵和丙酮洗涤后，真空干燥得磁性纳米 Fe3O4 粉体 。 共沉淀法合成工艺简单，易于操作，但反应过程中影响因素比较多，如铁盐的类型 、 沉淀剂的种类及加入方式 、 反应终点的 pH 值 、 熟化处理等都有影响，因此，许多科研 工作者对共沉淀法进行了改进，在其基础上提出了氧化沉淀法 、 分解沉淀法 、 微波沉淀法 、 交流电沉淀法 、 超声沉淀法等制备方法 。 1.2 水热法 Fan 等 8在高压釜中放入 1.
4、39 g FeSO4、 1.24 gNa2S2O3、 14 mL 蒸馏水，缓慢滴加 10 mL 1.0 mol/L的 NaOH 溶液，不断搅拌，反应温度为 140 ， 12 h后冷却至室温，得到灰黑色沉淀物，经过滤 、 水和无水乙醇洗涤，在 70 真空干燥 4 h，得到 50 nm 准球形多面体 Fe3O4 纳米晶体 。 该法产率高于 90%。 该法是在高温高压条件下， 在水溶液或蒸气等流体中合成欲制备的氧化物，具有原料易得 、 粒子纯度高 、 分散性好 、 晶形好且可控及成本相对较低等优点 。 1.3 柠檬酸钠法 铁氧化物 /金磁性核壳纳米粒子参照文献 10的方法制备 : 取少量的铁氧化物纳
5、米粒子加入到等同体积的 011 mol/L柠檬酸钠溶液中 , 超声分散后加水至 20 mL, 在机械搅拌下 , 加入过量的 80 mmol/L 盐酸羟胺溶液 , 混合均匀后 , 滴加入 2 mL 质量分数为 011%的HAuCl4 溶液进行包裹 , 反应约 1 h,再加入 2 mL 质量分数为 011%的 HAuCl4 溶液进行包裹 , 加入 HAuCl4 包裹 3 次后 , 溶液逐渐变为深红色 . 反应结束后 , 对溶液进行磁性分离 , 去除上层清液 , 得到铁氧化物 /金磁性核壳纳米粒子 . 2. SERS 标记免疫检测 SERS 标记免疫技术是在生物免疫应答的基础上发展起来的 , 主要基
6、于类似三明治结构的构建 , 基底上的固相抗体与标记抗体通过与抗原的结合形成“固相抗体 2待测抗原 2标记抗体”夹心复合物 , 通过对标记分子 SERS 信号的识别进行免疫分析。与其他标记免疫技术相比 , 它具有其独特的优越性 : 首先拉曼光谱峰宽度通常比其他光谱如荧光要窄 10 100 倍 ; 其次拉曼散射受水的影响小 ; 再次 SERS 信号很少受光致褪色的影响 , 所以可在一定程度上为获得较好的信号而适当地延长检测时间。另外 SERS 标记物不会发生自猝灭 , 可以通过增加标记抗体上标记物的数量来增强 SERS 信号 , 提高检测灵敏度。 2 1 发展历史 这项技术最早是由 Rohr 等
7、9于 1989 年创立 , 他们首先利用表面增强共振拉曼光谱( SERRS) 来研究生物分子之间的相互亲和性 , 将二甲基偶氮苯胺以共价键与抗甲状腺促进激素 ( TSH) 抗体相连 , 形成标记抗体 , 以银表面固定 anti2TSH 抗体作为固相抗体 , 二者与待测液中 TSH 抗原形成夹心复合物 , 利用夹心复合物中标记物的 SERRS 信号来进行免疫分析 , 但这种固相抗体的均一性较难控制 , 重现性较差。随着生物技术的发展 , SERS 在酶联免疫和基因工程领域也有了较大的研究进展。 Dou 和 Mirkin11等分别将SERS 标记免疫技术用于酶联免疫分析与 DNA 序列识别。这些研
8、究为以后 SERS 标记免疫检测打下了坚实的理论与实验基础 , 引起了世界各研究小组的广泛关注。而最具代表性的研究当属 Porter等 10于 1999 年首 次将 SERS 标记分子和羊抗小鼠 IgG直接与金溶胶相作用形成标记免疫溶胶 , 通过相应小鼠抗原与固定在基底上的羊抗小鼠 IgG相连 , 进行SERS 免疫检测。采用这种标记免疫溶胶方法 , 金纳米粒子表面产生的电磁场将直接影响相连的标记分子 , 可产生较强的 SERS 信号 , 且不存在距离影响 SERS 信号的问题。因此无需选用特定的吸收光谱与入射光波长相匹配产生共振效应的分子 , 拓宽了标记分子的选择范围。 目前 , SERS
9、标记免疫研究的热点主要集中在如何减少非特异性吸附与提高灵敏度两方面 , 纵观当前的 SERS 标记 免疫领域 , 固相基底的制备与修饰以及抗体的标记是研究的关键。制备均一性良好的固相基底是 SERS 标记免疫检测的基础 , 采用合适的标记方法兼顾生物活性同样是提高检测性能的关键。 2.2 SERS 标记免疫检测灵敏度的提高 SERS 作为一种免疫检测的新方法在近年来得到了很大的发展 , 它在标记免疫研究领域无疑也是一个理想的工具 ,特别体现在它的谱带窄 , 灵敏度高的特点上。通过采用具有表面增强效应的固相基底或标记颗粒进行 SERS 免疫检测充分发挥了 SERS 特殊的表面增强效应。同时采用较
10、强 SERS效应的标记分子 , 增加标记分子吸附量有利于提高免疫分析的灵敏度。目前提高 SERS 标记免疫检测灵敏度的方法主要有 : (1) 多官能团标记 Porter 等 10采用的双官能团标记分子代替单官能团标记分子是提高检测灵敏度的方法之一 , 图 2 为其标记示意图。双官能团标记分子一端通过巯基与金纳米粒子相连 , 另一端与抗体相连 , 这种方法大大增加了金纳米粒子表面吸附标记分子的数量 , 提高了检测的灵敏度 , 其待测抗原的检出限达到了 1 pg mL - 1 。 (2)金银核壳纳米标记 葛明 等 5金银核壳纳米标记是在金银染色基础 上发展起来的新兴免疫标记技术。我们课题组采用 A
11、g核 Au壳复合纳米粒子 , 以苯硫酚 ( TP) 为标记分子 , 发现在其表面的SERS 增强随 Au 摩尔比例的增加呈现先增强后减弱的趋势 , 其最大增强为相应银纳米粒子的 10 倍。而这较强的 SERS 增强效应是来自于表面孔洞所产生的电磁场增强 , 将这种特殊的核壳纳米粒子应用于 SERS 标记免疫检测 , 既可以获得较高的检测灵敏度 , 同时金壳的存在又不会使检测的蛋白质分子失活以 42MBA 为标记进行 SERS免疫检测 , 他们发现在银壳为 3 nm 时 , 获得了最大的 SERS增 强效应。但 Au核 Ag壳复合纳米粒子的薄层银壳是否对抗体抗原的活性有较大影响还有待考证。 2.
12、3.磁性纳米粒子的 SERS 活性 崔颜 等 13-14在这方面做了大量的研究： 1 mL 磁性纳米粒子溶胶中分别加入 1 L 10 mM 的苯硫酚的 SERS 谱图。磁性 Fe2O3 / Au 纳米粒子外包覆 Ag 壳后组成的双金属壳层的SERS 强度明显要强于单金属 Au 壳。同时其 SERS 强度随 Ag :Au 比例的增加 ,呈现先增强后减弱的趋势 ,并且当 Ag2NO3 的用量在 0. 7 mL 时 ,所制备的纳米粒子表面的 SERS 强度达到最大 ,此时约为 Fe2O3 / Au表面 SERS 强度的 8 10 倍。结合其 SEM 电镜分析结果 ,这可能是由于核壳纳米粒子表面产生的
13、孔洞周围产生较大的电磁场增强 ,使得吸附在孔洞周围的分子的 SERS 增强比完整壳上的 SERS 增强要高得多 ,此外当 Ag 外层并不十分厚时 ,可同时观察到 Au 壳与 Ag 壳的表面等离子体吸收 ,根据有关金银纳米粒子混合组装后发现可增强两者 SERS 效应的结果 ,我们可推断此时两者之间可发生耦合增强效应 ,因此观察到随 Ag 变厚 ,SERS 效应增大。随着更多银在表面生长 ,内核 Au 的 影响越来越小 ,同时从 SEM 图可见表面变得越来越光滑 ,原来的孔洞效应以及 Au 和 Ag 之间的耦合作用的消失导致 SERS 效应反而减弱。 总结 通过种子生长法成功合成了多功能的磁性 F
14、e2O3 / Au/ Ag 核壳纳米粒子 ,并通过 SEM和 UV2vis 表征了其结构及光学性。验证所制备的磁性复合纳米粒子是一种很好的 SERS 基底 ,为拓展此类多功能材料奠定了良好的实验基础。提高 SERS 免疫分析的灵敏度及消除非特异性吸附带来的假阳性干扰 , 成为近年来令人关注的热点。各种高度灵敏的标记示踪体系为 SERS 标记免 疫分析的集成化提供了前提。痕量的生物检测 , 高示踪性的标记分子是研究的关键。同时 , SERS 标记免疫检测基底的制备与修饰 (包括生物分子在基底上的组装包被技术 ) 还需要进一步成熟。作为表面化学发展起来的 SERS 技术为生物免疫化学提供了新的手段
15、 , 目前已有端倪说明这两种技术的联用可以发挥其特殊的作用 , 只需在设计上再加以改进 , 这些目标是不难达到的。 参考文献 1 Jurgons R, Seliger C, Hilpert A, et al. Drug loaded mag2netic nanoparticles for cancer therapy J . J Phys:CondensM atter, 2006, 18 (38) : 2893-9021 2 Cunningham C H, Arai T, Yang P C, et al. Positive con2trast magnetic resonance imagin
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