1、血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳根据迁移率分离,操作步骤 标记 用铅笔在薄膜无光泽面(毛面)一端2cm处 轻画一细线 ，并在右上角做好标记。浸泡 将醋酸纤维素薄膜毛面向下，在缓冲溶液中浸泡，使其充分浸透。点样 用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体(不要太干），利用载玻片 一侧蘸取样品，45度角于毛面细线处点样。 电泳 将薄膜毛面朝下，置于电泳槽的纱布桥上，点样端置于负极； 膜条紧贴纱布，待平衡5min后通电，在U=120V电泳40min。 染色 将薄膜取出后，置于氨基黑10B染色剂中，染色5min。漂洗 将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，滤纸吸干。,电泳技术,发展概念基本原理影响因素种类应用
2、,The Nobel Prize in Chemistry 1948ArneTiselius,1808年-俄国物理学家Ress发现电泳现象。1937年-瑞典科学家Tiselius首先设计出世界上第一台自由电泳仪，并建立了“移界电泳”分离模式。以电泳作为一种分离技术，首先证明了血清蛋白是由白蛋白、1、2、和球蛋白组成的。 for his research on electrophoresis and adsorption analysis, especially for his discoveries concerning the complex nature of the serum prot
3、eins,发展,20世纪50年代，以支持介质为主的电泳模式不断涌现，如滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉薄膜等。60年代以后发展了以凝胶为主的支持物的电泳方法，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶电泳等。1967年在凝胶电泳的基础上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。90年代又推出了分辨率极高的高效毛细管电泳。如今，各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。,基本概念,带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳(electrophoresis) 。带电粒子由于带电性质及电荷量不同，在一定的电场强度下具有不同的移动速度及方向。电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行
4、分离的一类实验技术。,电泳用于分离物质的原理（1）,电荷量及方向：蛋白质为例,等电点,电泳用于分离物质的原理（2）,迁移率：以来表示，即单位电场强度时粒子运动的速度，取决于带电粒子的电荷量Q、粒子大小和形状。,电泳用于分离物质的原理（3）,具体实验中：,V:泳动速度cm/秒or分d:泳动距离cmt:电泳时间 (秒/分)E:电场强度 伏特/cm,u:泳动率or泳动度(cm2/伏秒or分)U:电压l:支持场的长度 (有效长度),设：混合物中有A、B两物质：,物质A在电场中移动的距离为: dA= AVt/l 物质B的移动距离为：dB= BVt/l 则两物质移动距离之差为： d=(dA-dB)=(A-
5、B)Vt/l即：物质A、B能否分离取决于两者的迁移率,影响电泳速度的因素：内因,1.净电荷：被分离物带电荷量与电泳速度成正比 2.质点大小：颗粒直径愈小愈快，分子大小与电泳 速度成反比 3.质点形状：球形分子比纤维状分子泳动快。,影响电泳速度的因素：外因（1）,溶液的pH值 决定带电粒子的解离的程度，即该物质带净电荷多少的决定因素。对蛋白质等两性电解质而言，pH值离等电点越远，则颗粒所带净电荷越多，泳动速度也越快，反之，则越慢。 为了使电泳过程中溶液pH值恒定，必须采用缓冲溶液。一般常用的电泳缓冲液pH范围在4.59.0。,影响电泳速度的因素：外因（2）,溶液的离子强度 维持一定的缓冲容量，需
6、要一定浓度的离子，它主要与其浓度和价数相关。 I=1/2CiZi2 缓冲液I越大，降低样品（蛋白质）带电量，泳动速度变慢，最后破坏胶体，但区分条带清晰。 缓冲液I越小，缓冲容量小，pH不稳定，样品易扩散；则泳动速度快，条带分离差。 一般在0.02-0.2。,影响电泳速度的因素：外因（3）,电场强度 是指电场中每厘米的电位降，也称电位梯度或电势梯度。电场强度对电泳的速度起着重要作用，电场强度高，带电颗粒泳动速度快，电场强度低，带电颗粒泳动速度慢。 电压越高，产热增加，高压电泳需备冷却装置。 否则？,影响电泳速度的因素：外因（4）,支持介质(1)物理化学性质稳定：在电泳过程中不受环境因素的影响，保
7、持原有的状态和性能。(2)化学惰性：在电泳过程中不与缓冲系统中的各种离子和待分离的生物大分子发生化学反应，不干扰生物大分子的电泳过程。(3)分布均匀：内电渗小，结果重复性好。,电渗作用,液体对固体支持物的相对移动，在电场中，由于多孔支持物吸附水中的正或负离子使溶液相对带电，在电场作用下，溶液带动样品向一定方向移动。,种类：,自由界面电泳区带电泳：纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。连续系统：电荷效应、分子筛效应不连续系统：浓缩效应、电荷效应、分子筛效应盘状平板式垂直板式,电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，
8、受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。,电泳技术的应用,分离纯化样品测定分子量组建物理图谱鉴定重组体分子杂交测序PCR检测分子标记检测,醋酸纤维素膜：是一种由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔膜。广泛应用于医学临床中各种生物分子的分离分析中。（醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白）琼脂糖凝胶：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。（等电聚焦电泳分离血红蛋白和细胞色素C） 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质
9、。,电泳介质：,原理：以醋酸纤维素薄膜为支持物，在PH=8.6的巴比妥缓冲液中，血清蛋白的PI均小于8.6，带负电荷，电泳时向正极移动。由于迁移率不同而被分离。,醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,表-1 血清中各蛋白质的相关特性,种 类,分子量(万）,PI,分 布(%),清蛋白,1-球蛋白,2-球蛋白,-球蛋白,-球蛋白,6.9,5.0,9.0,13.0,11.0,4.8,5.0,5.0,5.2,6.8-7.5,55,2.130.8,4.172.5,1.225,15.6,蛋白质染料氨基黑10B 酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料。这类染料对不同的蛋白质结合量不同，染色
10、不均一和高背景影响蛋白质的定量。染色灵敏度较低，现在这类染料已很少应用，被灵敏度较高的考马斯亮蓝所代替。,优缺点,醋酸纤维薄膜广泛应用于医学临床中各种生物分子的分离分析中，如血清蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、类固醇及同工酶等。它具有简单快速、对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后蛋白质区带更清晰等优点，电渗作用虽然较高但很均一 ，不影响样品的分离效果。不足之处是分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低，由于薄膜厚度小（约10100m），样品用量很少，不适于制备。,前清蛋白,清蛋白,-球蛋白,-球蛋白,临床意义：,白蛋白：主要在肝脏合成，所以与肝脏疾患密切相关。球蛋白的增加与发热有关，与炎症有关。球蛋白增加常伴随血中脂质的增加。球蛋白含有抗体成分，在许多慢性感染、免疫性疾病中有异常。例如：多发性骨髓瘤病人在球蛋白与球蛋白之间出现一个尖峰：M蛋白 肝硬化病人球蛋白增加，白蛋白降低。,思考题,预习：实验五、六,凝胶层析分离蛋白质混合物的原理？何谓分子筛效应？DNS氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析中，各种氨基酸是怎样得到分离？,P2：1、2、3,
