1、 本科 毕业论文 （ 20_ _届） 苯酚对发光菌 Q67 的急性毒性研究 所在学院 专业班级 环境工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 :利用发光细菌的发光原理，以青海弧菌 Q67变种作为毒性测试物种，研究了 12种苯酚类化合物的急性毒性。结果表明，不同物质对 发光细菌的急性毒性不同，在一定浓度范围内， 2,4-二氯苯酚对发光细菌的毒性与其浓度呈正相关。在 pH为 9.0，苯酚类化合物与发光细菌作用 15 min时， 测定了苯酚、 对甲氧基苯酚、对硝基苯酚、 间硝基苯酚、对氯苯酚、 2-氯苯酚、 3-氯苯酚、2,3-二氯苯酚、 2,4,5-三氯苯酚、 2,4,6-
2、三氯苯酚、 2,4,6-三硝基苯酚、 邻甲苯酚 共 12种化合物 对 青海弧菌 Q67的 EC50值，其 EC50值依次为 0.1835、 0.2027、 0.0530、 0.1145、 0.0629、 0.1782、 0.0941、0.0354、 0.0018、 0.0411、 0.0872、 0.2054g/L。说明其毒性为以下顺序： 2,4,5-三氯苯酚 2,4,6-三氯苯酚 2,3-二氯苯酚 2,4,6-三硝基苯酚 对 硝基苯酚 对氯苯酚 3-氯苯酚 间硝基苯酚 2-氯苯酚 对甲氧基苯酚 邻甲苯酚 苯酚。实验表明不同种类的取代基，其毒性不同；当 取代基种类相同时 ,毒性随取代基个数增加
3、而增大 ;当取代基种类和个数均相同时 ,毒性与取代基位置有关。 发光细菌法作为一种速度快、操作方便、成本低廉的生物监测方法，将在农产品污染物毒性评价和农产品安全快速检测中有着广泛的应用前景。 关键词 : 青海弧菌 Q67；苯酚类化合物；毒性测定； EC50 II Abstract: The test was conducted on toxic effect of 12 phenols using Qinghaiensis sp Q67 on the basis of luminescent principle. The results showed that at certain range
4、 of concentrations, the relative luminescent intensity positively correlated with the concentration of the 2,4-Dichlorophenol. The EC50 of phenol, p-methoxy phenol, p-nitrophenol, m-nitrophenol, chlorophenol, 2-chlorophenol, 3-chlorophenol, 2,3-dichlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4,6-Trichlorop
5、henol, 2,4,6-nitro-phenol, o-cresol were 0.1835、 0.2027、 0.0530、 0.1145、 0.0629、 0.1782、 0.0941、 0.0354、 0.0018、 0.0411、0.0872 、 0.2054 g/L. The strength of the order of their toxicity: 2,4,5-trichlorophenol 2,4,6-trichlorophenol2,3-dichlorophenol2,4,6-trinitrophenolp-nitrophenolp-chlorophenol3-Chlo
6、rophenolbetween nitrophenol2-chlorophenolp-methoxy phenolo-cresol phenol. Experiments show that the different types of substituents, the toxicity is different; when with the same type of substituent ,their toxicity is increase with the number of substituents; when with the same type and number of he
7、terogeneous substituents ,their toxicity is related to the position substituent.Bioluminescence is a good bio-monitoringmethod that would have a wonderful prospect. Keywords: Qinghaiensis sp Q67; phenols; Toxicity; EC50目 录 1 绪论 . 1 1.1 研究背景及意义 . 1 1.2 相关研究的最新成果及动态 . 5 2 实验部分 . 7 2.1 实验原理： . 7 2.2 试剂
8、与仪器 . 8 2.3 发光细菌冻干菌剂的复苏 . 8 2.4 培养液的配置 . 8 2.5 培养基的配置 . 9 2.6 发光菌的培养 . 9 2.7 毒性测试 . 9 2.7.1 2,4-二氯苯酚的浓度效应曲线测定 . 9 2.7.2 各化合物半数发光抑制浓度 15min-EC50 的测定 . 10 3、分析与讨论 . 12 3.1 2,4-二氯苯酚的浓度效应曲线 . 12 3.2 相同 P H 条件下苯酚类化合物对发光菌的毒性 . 12 4、结论 . 13 致 谢 . 错误 !未定义书签。 参考文献 . 14 1 1 绪论 1.1 研究背景及意义 自 70年代 Simmon发现自来水中存
9、在致突变性有机污染物以来，在自来水及其水源中先后发现多种遗传毒性物质。美国环保局 (EPA)水质调查发现供水系统中含有机污染物 2110种，饮用水中含 765种。 1994年以来，美国在饮用水中发现了 100多种合成有机物，如多氯联苯、多环芳烃等，具有“三致”作用。美加五大湖是北美及至全世界重要湖泊群之一， 1999年的监测数据表明其中首要污染水体中仍能检测出 1970年以来已禁止使用的有毒污染物，如多氯联苯、滴滴涕、二恶英、狄氏剂等。随着工业的迅速发展，目前我国不仅面临由传统污染物引起的水环境富营养化和好氧有机污染，而且还面临水环境有机毒物污染的严峻挑战。近几年来，我国不少水体己遭到不同程度
10、的有机毒物污染，甚至在某些饮用水水源中检出众多的有机毒物。水利部门于 1994年对第二松花江吉林、扶余段、松花江干流哈尔滨四方台段，黄浦江上海临江水厂、松浦大桥段，珠江广州员村水厂段，北京官厅水库上游洋河水库响水堡段，淮河蚌埠、淮南段、颖河颖上闸段，长江扬州三江营段等 14个典型河段进行 了有机物污染状况调查检测，共检出 197种有机化合物 (“三致”物质 25种，被美国环保局列出的优先污染物达 53种 )。其中，烃类 43种、邻苯二甲酸酯类 8种、酚类 16种、醇醚类 19种、醛酮类 12种、有机酸酯类 12种、卤代烃类 7种、取代苯类 28种、胺类 18种、多环芳烃类 18种、杂环化合物
11、16种。据统计，在我国的 7大水系 110个重点河段中，不适合作饮用水源的河段已接近 40；城市水域中 78的河段不适合作饮用水源，约 50的城市地下水受到污染，水源污染加剧了我国水资源短缺的矛盾。 随着有毒物质引起的环境危害逐渐加深，世 界各国纷纷出台相关规定要求在 2007-2010 年实现水质毒性控制，而我国为了保障水质安全，已将水质毒性纳入环境控制标准。由于水体中同时存在多种有毒物质产生叠加毒性，需要采用生物效应的原理来综合反应有毒物质的综合毒性。目前常用的生物监测方法包括水生动物法和微生物两类方法，其中微生物法中发光细菌法以其较高的灵敏度和简便得到广泛的关注，在许多国家作为毒性评价的
12、主体方法。 21世纪以来随着科学的不断发展进步，人类合成越来越多的化学品。水环境作为工农业废物的最终排放点，污染现象越来越严重，超过了水体的自净能力，从而 影响水体的正常功能，造成水体污染。这些污染物绝大多数来自城市生活污水和造纸、采矿、印染等工业废水，其成份主要包括多环芳烃、苯酚类衍生物、苯胺类衍生物等有机污染物。这些物质中一部分属于难降解污染物，其本身及其在环境中的转化产物在水体中长期积累，达到很高的浓度，不仅引起水生生物种2 群和群落结构的变化，而且严重时将导致水生生态系统的破坏和崩溃。水体污染达到一定程度后，除了直接影响水生生物的正常生活外，还直接或间接地威胁人类健康和生产活动，因此为
13、了保护水源和水生生态系统，必须利用化学方法和生态毒理学测试法进行评价。化 学方法是普遍采用的一种方法，但化学方法存在许多不足，而现有的化学分析手段十分有限，因此大多数污染物不能被鉴定，而且也不能预测毒物之间的相互作用。生态毒理学测试法可以弥补化学方法的不足，在一定程度上能预测毒物之间的相互作用。生态毒理学是七十年代发展起来的一门新兴的边缘学科，主要研究污染物 环境一机体三者之间的关系以及有毒物质对生物在个体、种群、群落和生态系统水平上的毒性效应。以前毒性方面的许多研究工作是用水生态系统食物链中各代表性生物如藻、蚤、鱼进行急、慢性实验，并用这些结果作为评价环境化学物质的毒性强度及可 能对生态系统
14、造成影响的一种指标，现在这些方法很多都已作常规检测方法，但它存在耗时长、花费大、只能反映对个体和群落的后期影响等问题。而发光菌的急性毒性试验能与现代光电检测手段相匹配，具有测试快速，经济，节省空间且可靠等优点而备受关注。 20 世纪 80 年代初，国外科学家首次从海鱼体表分离和筛选出对人体无害，对环境敏感的发光细菌，用于检测水体的生物毒性，现已成为一种简单、快速的生物毒性检测手段。目前国内外使用的大多为天然海洋细菌，其在毒性响应灵敏性、测试条件严格等方面存在一定的缺陷，而近年来通过基因工程技术从发光细 菌中克隆荧光素酶基因 (Lux),并转移到对污染物有特别敏感性的受体菌中表达，或重组入对特定
15、细菌群有专一感染性的噬菌体基因组中，构建成基因工程菌或工程噬菌体用于水质毒性监测，能极大地提高监测的效率和灵敏性。发展起来的重组发光细菌比天然发光细菌对有毒物质的响应更灵敏，而且可通过构建不同的菌株实现不同要求的毒性评价（扩展其毒性广谱响应性强化其对特定物质的特异性响应）；重组发光细菌的测试条件更为温和，可与生物传感器技术相结合，实现环境污染的现场连续、在线毒性监测；重组发光细菌技术自创立至今，已示范性应用于多种污染 物的毒性评价 ,显示了较传统发光细菌监测法的明显优势 1，迅速成为污染生物监测研究的热点。 发光细菌法是 70 年代后期发展起来的一种新的生物毒性检测方法 2，与传统的生物检测方
16、法(如鱼、蚤 )相比，该法具有快速、简便、灵敏、廉价和应用广泛等特点。化合物对发光菌的毒性，与对其它生物的毒性数据有一定的相关性 3。因此，该方法对有毒化学品的筛选和评价具有重要意义，也可为研究化合物对其它生物的毒性提供基础数据。苯胺类化合物在水中有离子态和非离子态 (分子态 )两种存在形态，虽然两种形态均可对生物产生毒性，但分子态的毒性 贡献更大些。因此， Blum 和 Speece4认为，有机物对生物的毒性贡献主要是分子态所致，分子态所占比例越大，3 对生物的毒性越大。有关苯胺类化合物对水生生物的毒性，前人已作了一些研究 5，但有关其在不同 pH 值下的毒性研究报道很少。 随着科学技术的进
17、步，工农业生产的发展，人类合成了越来越多的化学品，水环境作为工农业废物的最终排放点，污染现象越来越严重，超过了水体的自净能力，从而影响水体的正常功能，造成水体污染。这些污染物质绝大多数来自城市生活污水和造纸、采矿、印染等工业废水，其成份主要包括多环芳烃、多氯联苯 (PCB)等有机物和重金属污染物。这些物质中，一部分属于难降解污染物，其本身及其在环境中的转化产物在水体中长期积累，达到很高浓度，不仅引起水生生物种群和群落结构的变化，而且严重时将导致水生生态系统的破坏和崩溃。水体污染达到一定程度后，除了直接影响水生生物的正常生活外，也直接或间接地威胁人类的健康和生产活动。为了保护水源和水生生态系统，
18、常采用多种方法对水质进行监测和评价，并因此建立了基于化学和生物学的水质评判标准（或基准）。 对水质监测和评价的方法大致可分为两大类。一类是化学方法，即采用各种仪器分析方法，直接 分析测定水体中有害物质的种类和它们的浓度，以及与之有关的参数，如色度、 COD、 BOD等，以此为依据制定出污染物浓度控制标准。这类方法执法依据充分、管理界限明确，不仅能确定有害物质的种类，对其中部分污染物还能准确地测定它们的浓度或含量，因此是普遍采用的方法。 但是，化学方法也存在许多不足 6，已经发现具有明显生物和生态效应的污染物种类繁多，数量巨大，而现有的化学分析手段十分有限，环境样品中能够被鉴定的污染物仅占实际存
19、在污染物的很少部分。由于大多数污染物不能被鉴定，因此不能根据浓度数据推测它们的毒性效应，从而 不能排除样品中未被检测出的污染物的潜在毒性效应。 另一方面，即使所测定的污染物能够代表水体被污染的性质，由于不能预测毒物之间的相互作用，因此也很难从不同污染物的浓度分析数据来预测废水其真正危害。换言之，化学分析的数据并不能从整体上反映水质的优劣，或反映污染物对生物和生态系统的影响。就污染物所产生的生物毒性而言，某一种污染物对水生生物的毒性，并非完全取决于含量等化学参数。由于环境条件的复杂性，与污染物共存的其他物质以及环境条件如： pH、氧化还原状态等的变化等，同时在很大程度上影响了其生物有效性。因此需
20、要另一类 方法，包括生物、生态、和毒理学方法等来评价水质。 生物评价基准（ Biocriteria）就是利用敏感生物来测试化学污染物的毒性影响。最早是一些生物学家针对污染的生物评价提出可行的方法，例如 Hart 利用淡水鱼评价工业废水、化学物质和其4 它物质的毒性 7， Doudoroff 进行了工业废水对鱼的急性毒性生物评价 8。到了 70 年代，生物评价越来越普遍，不但采用鱼，也采用无脊椎动物和藻类。 早期采用的生物毒性测试手段主要是单指标生物毒性实验 9，即将一种生物暴露于两个或更多浓度梯度的有毒物质中，保持其他条件恒定， 以观察生物效应（死亡或抑制；生理改变；行为改变等）。这种实验能够
21、较准确地反映出某种化合物对某一特定生物产生的特定的毒性作用。然而，水体中有成千上万种生物，对毒物的敏感程度存在极大的差异，因此很难从一种生物的毒性效应推测对另一种生物的影响 10。即使对同一种系的生物，其对某种污染物的敏感性也存在着明显的差别。因此，仅以一种生物来对某一污染物的生物毒性进行评价是远远不能说明问题的。由此至70 年代后，发展了多指标生物测试 (Multispecies Bioassay)。多指标生物测试是利用同一营养级的几种生物同时 对某个环境样品或污染物进行生物毒性实验，在一定的统计学规律上其结果能够说明该样品或污染物对这一营养层次生物的平均毒性效应。针对不同营养层次，发展了成
22、组生物检验 (battery bioassay)，即利用不同营养级的有代表性的生物进行生物毒性检验。在统计学意义上，测试结果能够部分反映污染物对生态系统的影响。 近年来对生物毒性的研究更加趋向于微观。越来越多的科学家致力于能反映持久性污染物作用本质，并能对污染物早期影响进行检测的指标，试图从分子水平基因调控的深度上去阐明毒物中毒机理，并在此基础上提供相应的防范措施 。由此而发展形成了分子毒理学，遗传毒理学等新的监测手段，以对污染物的生物毒性进行快速、早期的预测。 不仅不同生物类群之间生物对毒物的敏感性，存在着很大的差异，即使是同一类生物，不同种之间对化学物质的敏感性也有着明显的差异。因此，在进
23、行毒性试验时，首先要考虑试验生物的选择，这对试验的顺利进行和试验结果的使用都是极为重要的。当然，试验目的不同，选用的试验生物也往往有所不同。用于生物毒性评价的生物选择，不同的管理机构制定了不同的标准 11。美国环保局第一章水环境中生物毒性测试方法的发展及展望推荐至少使用 3 种生物 （如鱼、无脊椎动物和一种植物）。也有报道认为应选用至少 4 种不同营养级有代表性的生物，包括：微生物、植物、无脊椎动物和鱼。 除了需要对环境样品或污染物进行毒性测试外，还有必要对它们进行快速毒性评价（ Toxicity Screening）。在进行快速毒性评价时，需要选择一些有显著代表性的毒性测试方法和生物作为早期
24、急性毒性指标，常用的是鼠类、鱼类和水生节肢类动物 12。在急性毒性分析方面，新的检测手段不断建立，其指示生物包括细菌、藻类、底栖软体动物和鱼等，其中发光菌因其独特的生理特性、与现代光电检测手段相匹配的 特点，更由于其相比于其他生物的快速、经济、节省空间且可靠等5 优点而备受关注，由此发展了利用发光菌进行毒性检测的方法。 1.2 相关研究的最新成果及动态 发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射可见荧光的细菌。在一定条件下发光细菌的发光强度是恒定的，与外来受试物接触后，其发光强度将有所改变，在一定浓度范围内，有毒物浓度大小与发光细菌发光强度变化成一定比例关系，用发光检测仪测出它与待测物作用前后的
25、光强变化，就可以推算出综合毒性的大小。由于 L B T技术具有应用范围广、灵敏度高、相关性好、反应速度快等优点，被广泛 应用于环境监测及环境质量评价中。近年来，利用发光菌测定法检测环境污染物急性毒性倍受重视，并因检测时间短，灵敏度高而倍受世界各国广泛采用，我国于 1995年也将这一方法列为水质急性毒性的检验标准方法 (GB T15441 1995)。 林春等人 13研究了 2， 4-二硝基甲苯与对硝基氯苯、对硝基苯胺、对硝基苯甲醚、对硝基甲苯、对硝基苯酚等剂量混合时对明亮发光杆菌的联合毒性，最后评价 2， 4-二硝基甲苯与这 5种对位硝基苯的衍生物在等剂量混合时对发光菌的联合毒性均为协同作用
26、。 黄伟英等人 14择了 5种 污染物苯酚、间甲 基苯酚、苯胺、对硝基苯胺、硝酸铅，采用美国微板光度计测定了它们对发光菌青海弧菌 -Q67（ Vibrio-qinghaiensissp.-Q67的单一及联合毒性。应用非线性拟合技术模拟了这 5种物质及其混合物的剂量 -效应曲线，硝酸铅可用 Logit模型模拟，其它 4个物质能用 Weibull模型准确描述，所有拟合相关系数在 0.98以上，均方根误差在 0.02以下。根据纯物质的 EC50值，获得这 5个物质的毒性强弱顺序：硝酸铅对硝基苯胺 间甲基苯酚 苯酚 苯胺。混合实验设计了各物质在 EC50无观察效应浓度比例的混合。用浓度 加和与独立作用
27、模型对混合物毒性进行预测 . 覃记杰、刘树深等 15以淡水发光菌青海弧菌为指示生物， VeritasTM 微孔板光度计为发光强度测试设备，分别测定了 8 种硝基苯类化合物及其混合物对发光菌的发光抑制毒性。结果表明 8种硝基苯类化合物的剂量 -效应关系都可用 Weibull 模型有效描述，从模型估算的单个化合物的半数效应浓度值，可知对发光菌的毒性大小顺序为邻硝基苯胺 对硝基苯胺 对硝基苯酚 对硝基甲苯 邻硝基苯酚 间硝基苯酚 间硝基苯胺 硝基苯。按等毒性浓度比方法配制混合物进行联合毒性实验，结果表明这 8 种硝基苯 类化合物对发光菌的联合毒性可用独立作用预测，独立作用倾向于高估了它们的联合毒性。
28、 在国外， ThomuIka等 16用等效曲线图模型研究了硝基苯与三硝基苯在不同剂量配比下对发光菌的联合毒性，得出具有不同的联合作用。 Arrhenius等人 17研究了除草剂组成的混合物，效应指标为微囊藻，经光合作后来评价其相互作用的毒性以上的这些化合物的混合方式都采用等效应6 浓度比混合，这种混合方式只反映了混合物浓度空间中的某个方向。 由于复杂混合物的未知性，上述这些预测的多组分混合物依然属于简单混合物范畴，混合配比依然采用 等效应浓度比法，不过是采用了更多地效应浓度混合。然而，如何设计混合物浓度配比又不增加组合工作量使之对混合物整体浓度空间进行有效探索，自然模拟系统设计混合以及如何从单个污染物剂量一效应曲线数据有效预测混合物联合毒性，一直是一个亟待解决的问题。
