1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 甘草多糖提取过程中除蛋白方法的比较研究 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 : 采用水提醇沉法提取甘草粗多糖，采用 Sevag法、 三氯乙酸法 和酶法对甘草多糖进行脱蛋白研究。结果表 明： Sevag法、三氯乙酸法和酶法的蛋白含量分别为 52.7%、 51.8%、 47.8%，脱除率分别为 35.1、 41.3、 64.8；多糖含量分别为36%、 41.1%、 45.3%，损失率分别为 18.3、 30.2、 3.3。比较这三种脱蛋白方法，酶法具有良好的脱蛋白效果。 关键词 :多糖 ； Seva
2、g 法；酶； Abstract: Extracting polysaccharide with the method of decoction and alcohol sedimentation.The different ways to removing protein from II polysaccharide of Glycyrrhiza among Sevag method, Trimethoxysilane acid method and enzyme is compared. The results showed that Sevag method, Trimethoxysila
3、ne acid method and enzyme protein content of 52.7%、 51.8%、47.8%, removal rate was 35.1、 41.3、 64.8 ; polysaccharide content was 36%、 41.1%、 45.3% ,loss rate was 18.3、 30.2、 3.3 . Comparison of three methods of removing protein, enzymatic removal of protein with good results. Keywords: polysaccharide
4、; Sevag method ; enzyme ; ; 目 录 摘要 . 1 Abstract. . 2 1 绪论 . 4 2 材料与方法 . 5 2.1 材料和试剂 . 5 2.1.1 材料 . 5 2.1.2 试剂和药品 . 5 2.2 方法 .5 2.2.1 蛋白质标准曲线的制定 .5 2.2.2 葡萄糖标准曲线的制定 .6 2.2.3 Sevag 法脱蛋白 .6 2.2.4 酶法 6 2.2.5 三氯乙酸法 6 2.2.6 多糖含量的测定 . 6. 2.2.7 蛋白质含量的测定 .7 3 结果与分析 . 7 3.1 甘草多糖多糖含量和蛋白质含量的测定结果 . 7 3.1.1 甘草粗多糖
5、的制备结果 . 7 3.1.2 葡萄糖曲线制作的结果 . .7 3.1.3 蛋白质曲线制作 的结果 .8 3.1.4 甘草多糖的样品测定的结果 .9 3.1.5 Sevag法脱蛋白的结果 .9 3.1.6 三氯乙酸法的结果 .9 3.1.7 酶法的结果 .9 3.2 甘草多糖含量和蛋白质含量的数据分析 .10 4 结论 . 11 参考文献 . 12 致 谢 . 13 1 1 绪论 多糖是除核酸和蛋白质之外的另一类重要的生命物质，广泛存在于动物、植物、微生物等有机体中，具有能量储存、结构支持、防御功能等多方面的生物功能：同时多糖联系着细胞与细胞之间及细胞与外界的能量和物质传递，决定着大分子与细胞
6、及与其它分子之间的相互作用。近年来，植物、海洋生物及菌类等来源的多糖己作为有生物活性的天然产物中的一个重要类型出现，各种多糖所具有的抗肿瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性已相继被发现。据 Franz等报道 1，已有近百种植物的多糖被分离提取鉴定出来，这类多糖来源广泛且没有细胞毒性，应用于生物体毒副作用小，因此多糖生物资源的开发利用和研究日益活跃，成为天然药物、生物化学、生命科学的研究热点，糖生物学也被称为 “ 生物化学最的巨大前沿之一 ” 1，成为继基因组学、蛋白质组学滞后的另一研究热点。多糖结构复杂，其生物活性与其纯度和化学结构有着重要的关系。因此，对多糖的研究开发包含了多糖的提取，分离、
7、纯化。 甘草属植物为豆科蝶形花亚科多年生草本植物。该属植物共有 29 种 6 变种，我国产 18 种 3变种，其中乌拉尔甘 草、胀果甘草和光果甘草被各版中国药典收载，为传统中药甘草的来源。甘草作为我国最常用传统中药之一，素有“十方九草”之称，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药之功效，民间用于治疗乳腺炎、胃及十二指肠溃疡、脾胃虚弱、咳嗽、肝炎、咽喉肿痛、食物中毒等症 2。 甘草的现代化学及药理活性研究重点多集中在甘草酸、甘草次酸等三萜皂苷类化合物和甘草苷等黄酮类化合物上，而对甘草中另一类重要的生物活性物质甘草多糖的研究报道相对较少。而且关于甘草多糖药理的文献较少，主要是关于抗病
8、毒、抗肿瘤、提高免疫功能方面的。甘 草多糖对牛艾滋病病毒 (H )、腺病毒型 (AdV )和柯萨奇病毒 (CBV3)有抑制作用。王忱等 3发现甘草多糖对于小鼠 S-180 肿瘤具有抑制作用。郑尧等 4通过实验发现甘草多糖 (GPS)能提高小鼠网状内皮系统 (RES)功能，不仅对特异性免疫功能有促进作用，而且对非特异性免疫功能亦有增强。 2 2 材料与方法 2.1 材料和试剂 2.1.1 材料 仪器 超声波清洗机 旋转蒸发仪 紫外可见分光光度计 循环水式多用真空泵 型号 Uc-300 RE-5003 Uv-1200 SHB- 2.1.2 试 剂和药品 表 2-1 主要化学药品和试剂 名称 无水乙
9、醇 95%乙醇 氯仿 正丁醇 胰蛋白酶 型号 分析纯 化学纯 化学纯 化学纯 生物制剂 名称 葡萄糖 苯酚 考马斯亮蓝 丙酮 乙醚 型号 生物制剂 化学纯 生物制剂 化学纯 化学纯 2.2 试验方法 2.2.1 超声波法提取甘草粗多糖 取 甘草 100 克，粉碎成 10-20 目大小，放入 1000mL 的锥形瓶中，加水 500mL,水的量最 溢过 甘草 表面 2 厘米左右，放入超声波仪中，提取 30 分钟，过滤，重复一次，合并滤液 。 减压浓缩至 200ml,加 95%的乙醇 600mL，静置过夜，抽滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗三次得到甘草多糖 2.2.2 葡萄糖标准曲线的制作， 称取
10、0.5018g 干燥的无水葡萄糖，用蒸馏水溶解后转移至 100mL 容量瓶中，定容制成葡萄糖标夜。分别吸取葡萄糖标液 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6mL 置于 100ml 容量瓶中，用蒸馏水定容。 称取 50g 苯酚， 0.05g 铝片， 0.15g 碳酸氢钠置于三口瓶中，在 180下蒸馏，收集馏分，配置成80%的苯酚溶液，用时配成 65%的苯酚溶液。测定时，分别取 1mL 葡萄糖标准稀释液 于 25mL 比色管中，加 6%苯酚 1mL，浓硫酸 5mL，用漩涡混合气混匀后置于 50水浴中保温 30min，取出冷却至室温，以蒸馏水为空白，在 490nm 处测吸光度
11、。 2.2.3 蛋白质标准曲线的制作 准确称取牛血清蛋白 1.0758g，加蒸馏水溶解后移至 1000mL 容量瓶，定容制成蛋白质标夜。分别吸取蛋白质 10,20,40,60,80 mL 置于 100ml 容量瓶中，用蒸馏水定容制成标准蛋白储备液。 3 准确称取考马斯亮兰 0.1g，用 50mL95%乙醇将其溶解后移至 1000mL容量瓶中，再加入 100mL85%磷酸，用蒸馏 水定容，即为考马斯亮兰溶液。分别吸取 1mL 准蛋白储备液置于 25mL 比色管中，加入 5mL 考马斯亮兰溶液，用漩涡混合器混匀后放置 2 至 5min，然后以蒸馏水为空白，在 595nm处测吸光值。 2.2.4 S
12、evag 法 取甘草定溶液加入试管中，并向此溶液中加入其体积 1/5 的氯仿 正丁醇（ 5:1）溶液，震荡30min，经离心去除沉淀，脱蛋白。脱离心，取上清液，加 95%的乙醇至含醇量达 80%，离心，收集沉淀。依次用无水乙醇，丙酮，乙醚洗涤沉淀，沉淀物干燥后得出甘草多糖 1。 2.2.5 酶法 准确称取胰蛋白酶 2g，用 pH8 的蒸馏水溶解，置于 100mL 容量瓶中。精确配置 0.02g/mL 的多糖溶液，取 10mL 置于锥形瓶中，调 pH 为 8。将样品液于酶夜放置 37水浴锅中预热 10min，然后分别吸取酶液置于锥形瓶中再分别加入蒸馏水。 37恒温振荡器中震荡 30min 后，放
13、入 100水浴锅中灭酶 10min。冷却至室温，加 95%的乙醇 40mL，离心，收集沉淀，依次用无水乙醇，丙酮，乙醚洗涤沉淀，沉淀物经干燥后得到甘草多糖 2。 2.2.6 三氯乙酸法 取 50mL 甘草多糖溶液置于锥形瓶中，加入 5mL 的 40%三氯乙酸溶液 ，混匀放置，离心取上清液，加入 95%乙醇 200mL，离心，收集沉淀物，依次用无水乙醇，丙酮，乙醚洗涤沉淀，沉淀物干燥得到甘草多糖 3。 2.2.7 多糖含量的测定 准确称取制备得到的甘草多糖，用蒸馏水溶解后，置于 100 mL容量 瓶中并用蒸馏水定容，吸取该稀释液 lml置于 25mL比色管，以下操作过程同标准曲线的制作过程，按式
14、 (1)计算换算因子f=2.3243。 Wf CD 式（ 1） 式中， W为甘草多糖重量， C为甘草多糖在标准曲线上对应葡萄糖的浓度 (mg mL)， D为多糖的稀释倍数。 用少量蒸馏水溶解甘草多糖，置于 100 mL容 量瓶中，定容制成甘草多糖储备液。吸取甘草多糖储备液 1 00 ml置于 25 mL比色管中，以下操作过 程同标准曲线的制作过程。分别按式 (1)、 (2)计算 多糖含量和多糖损失率。 4 多糖含量 ( )= 100CD fW 式（ 2） 式中， C为甘草多糖在标准曲线上对应的葡萄 糖浓度 (mg mL)， D为稀释倍数， W为甘草样品的重量 (mg),f为换算因子 =2.32
15、43 多糖损失率 ( )= 12C 100C W 式（ 3） 式中， C1为未经脱蛋白处理甘草多糖在标准曲 线对应葡萄糖的浓度 (mg/mL)， C2为经过脱蛋白处理甘草多糖在标准曲线对应葡萄糖的浓度 (mg/mL)。 2.2.8 蛋白质含量测定 取 1 00ml甘草多糖浓缩液置于 25mL比色 管中，以下操作过程同标准曲线的制作过程。按照(3)式计算蛋白质含量， (4)式计算蛋白质去除率。 蛋白质含量 ( )= 100ADW 式 (4) 式中， A为甘草溶液中的蛋白质在标准曲线 上对应的标准蛋白的浓度 (mg/mL)， D为稀释倍数，W为甘草样品的重量 (mg)。 蛋白质去除率 ( ) =
16、121 100A A 式 (5) 式中， A1为未经脱蛋白处理的甘草溶液中的蛋白质在标准曲线上对应的标准蛋白的浓度 (g/mL)， A2为经脱蛋白处理的甘草溶液中的蛋白质在标准曲线 上对应的标准蛋白的浓度 ( g ml)。 3 结果与分析 3.1 葡萄糖与蛋白质的测定 3.1.1 葡萄糖标准曲线的测定 表 3.1 葡萄糖标准曲线实验结果 1 2 3 4 5 6 7 8 吸光度 0 0.223 0.4419 0.6668 0.8914 1.096 1.322 1.533 葡萄糖含量 /g 0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 5 y = 218.
17、73xR2= 0.999800.20.40.60.811.21.41.61.80 0.002 0.004 0.006 0.008葡萄糖含量吸光度系列1线性 (系列1 )3.1.2蛋白质标准曲线的测定 1 2 3 4 5 含量 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 吸光度 0.0173 0.0302 0.0683 0.0945 0.1421 y = 1.7291x - 0.0018R2= 0.993-0.0200.020.040.060.080.10.120.140.160 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1蛋白质含量吸光度系列1线性 (系列1 )6 3.1.4 甘草多糖
18、样品含量测定 甘草多糖样品多糖含量和蛋白含量的测定鉴 2.2.7-2.2.8，结果如下 样品重量 g 吸光度 含量 % 蛋白质 0.06 0.0138 58.2 多糖 0.06 0.3051 36.3 3.1.5 sevag法脱蛋白测定结果 得到产品 样品 蛋白质吸光度 葡萄糖吸光度 蛋白质去除率 % 多糖损失率 % 多糖含量 % 蛋白质含量 % 1 0.1521 0.0512 0.013 0.267 12.3 4.8 41 54.7 2 0.1332 0.0357 0.008 0.198 42.8 17.1 37 51.2 3 0.0912 0.0457 0.006 0.168 50 33
19、30 49.6 3.1.6 三氯乙酸法脱蛋白含量测定 得到产品 样品 蛋白质吸光度 葡萄糖吸光度 蛋白质去除率 % 多糖损失率 % 多糖含量 % 蛋白质含量 % 1 0.1862 0.0452 0.018 0.288 32.5 21.3 38.4 55.1 2 0.1752 0.0498 0.017 0.283 41.5 30.5 41.1 51.9 3 0.1558 0.0359 0.014 0.271 48.2 38.1 43.6 48.3 3.1.7 酶法除蛋白含量的测定 得到产品 样品 蛋白质吸光度 葡萄糖吸光度 蛋白质去除率 % 多糖损失率 % 多糖含量 % 蛋白质含量 % 1 1.
20、425 0.0532 0.007 0.211 57.2 2.3 47.3 54.1 2 1.321 0.0486 0.005 0.162 64.2 3.4 45.1 45.7 3 1.182 0.0489 0.004 0.130 73.2 4.2 43.8 42.8 3.2 甘草多糖多糖含量和蛋白质含量数据分析 每种方法对粗甘草多糖处理后都能达到精制多糖的效果，通过上表可以看出 sevag法处理后甘草多糖含量为 30%41%，蛋白质含量为 49%55%。三氯乙酸法处理后多糖含量为 3844%，蛋白质含量为 48%55%。酶法处理后多糖含量为 43%47%，蛋白质含量为 42%55%。但各个方法都能一定程度上的引起甘草多糖的损失。 sevag法，三氯乙酸法，酶法随着处理次数的增加甘草多糖的损失越大， sevag法处理后多糖损失率为 4.8%33%，三氯乙酸法为 21.3%38.1%，而酶法仅仅
