1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 高产灵菌红素培养条件优化 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 : 灵菌红素 (prodigiosins， PG)是一些放线菌、沙雷氏菌及其它细菌产生的具有重要生物活性的次级代谢产物。 本实验通过单因子 实验 ，对沙雷氏菌发酵工艺进行研究， 找到一个优于现有配方的培养基配比，实验结果得出利用 2%的花生为培养基，较甘油蛋白胨培养基，降低了 91.1%的生产成本。 关键词 : 灵菌红素； 沙雷氏菌； 发酵工艺优化 II Abstract： Prodigiosins with important bi
2、ological activity secondary metabolites are produced by a number of Actinomycetes, Serratia and other bacteria. Through the investigation of single-factor experiment design, Conditions of fermentation of Prodigiosins were investigated, The results of the use of 2% of peanuts litter than Glycerine-Pr
3、otein Culture, reducing 91.1% of the culture of the cost of production. Keywords： prodigious； Serratia; fermentation conditions 0 目 录 摘要 Abstract 1 绪论 （ 1） 1.1 灵菌红素的基本性质 （ 1） 1.2 选题的背景及意义 （ 1） 1.3 灵菌红素的研究动态 （ 1） 1.3.1 最新应用研究动态 （ 1） 1.3.2 生产现状 （ 2） 1.4 实验的目的、内容和难点 （ 3） 2 方法与材料 （ 4） 2.1 实验材料 （ 4） 2.1.
4、1 菌种 （ 4） 2.1.2 主要仪器与试剂 （ 4） 2.1.3 培养基 （ 4） 2.2 实验方法 （ 4） 2.2.1 种子的培养与优化 （ 4） 2.2.2 种子的扩大培养 （ 4） 2.2.3 红色素的提取 （ 5） 2.2.4 灵菌红素含量测定 （ 5） 2.2.5 单因素实验 （ 5） 3 结果与分析 （ 8） 3.1 单因素实验 （ 8） 3.2 生产成本计算 （ 13） 4 结论 （ 14） 参考文献 （ 15） 致谢 （ 17） 1 1 绪论 1.1 灵菌红素的基本性质 灵菌红素 (prodigiosins， PG)是一类天然红色素的总称， 1929 年由 Amark 等
5、研究 Serratia生 长 时 发 现 ， 包 括 prodigioSin ， prodigio Sin 25-C ， metacyc1oprodigiosin (MP)desmethoxyprodigiosi 和 uncedy1prodigiosin(UP)等，通常都有 3 个吡 咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构 1-2。灵菌红素属于脂溶性色素，易溶于甲醇和丙酮，不溶于水，在极性较强的酸性和碱性水溶液中微溶，在极性较弱的有机溶剂如乙醚或石油醚中微溶或不溶；灵菌红素对温度稳定，一般在 90 度以下都很稳定，但受 pH 的影响较大，酸性环境中能保持较长的时间，碱性条件下则损失较大； A1， Ca，
6、 K ， Ba 等金属离子对灵菌红素的稳定性影响不大， Zn 有使灵菌红素增色的作用， Mg 和 Mn 对灵菌红素有一定的破坏作用， Pb 可以络合灵菌红素，使之成为沉淀；白光和蓝光使灵菌红素发生光解，在红光和远红光下灵 菌红素则不会降解 3。 1.2 选题的背景及意义 随着社会的发展和人们生活水平的提高，合成色素对人体健康的危害越来越引人注目。大量的研究报告指出，基本所有的合成色素都不能向人体提供营养物质，一些色素还会危害人体健康。其中的危害包括一般毒性、致泻性、致突性（基因突变）和致癌性。因此合成色素作为食品添加剂的用量越来越少，甚至被众多国家禁止使用。而天然色素具有安全、无毒、色泽亮丽诱
7、人，尤一些天然色素本身就是人们日常饮食的成分，有一定的营养价值和药理保健作用，因此倍受人们的瞩目 4。 现今，天然色素 (PG)的种类并不多，灵菌红素就是天然色素之一。灵菌红素有一定的免疫活性，如抑制真菌、细菌和霉菌等功效，且具有抗肿瘤作用，因此具有很大的药用价值。除此之外，灵菌红素在纺织染色方面也比其他染料有优势，受到科研工作者和企业家的极大关注，具有创造巨大经济价值的潜力。 目前，主要是通过微生物发酵来获得灵菌红素，能产生灵菌红素的微生物主要有链霉菌属（ Streptomyces）、沙雷氏菌属（ Serratia）和假单胞菌（ pseudomonas）等种属 5-6。其中又以沙雷氏菌属生产
8、灵菌红素最受关注，报道也最多。但是，利 用微生物发酵的灵菌红素还存在很多问题，例如产灵菌红素的菌种不稳定，产量较低和成本偏高等。 1.3 灵菌红素的研究动态 1.3.1 最新应用研究动态 近年来灵菌红素的在医学、环境治理，纺织染色以及食品上的应用越来越广泛，具有很高的2 利用价值。 根据灵菌红素的抗肿瘤、免疫抑制活性、抗菌、抗疟疾活性等作用，在医学上有巨大的发展潜力。 在抗肿瘤方面，灵菌红素对比起另外一些化学疗法药剂，如 环磷琉胺 (cyclophosphamide)具有低细胞毒作用，只有当浓度大于 300nM 时才具有明显的淋巴细胞抑制作用。而后者在其有效浓度时毒性已非常高 7。 第一、灵菌
9、红素能引发 Cu2+诱导的双链 DNA 的裂解与其分子中 A 环的结构密切相关，完整的双吡咯环发色团结构是灵菌红素显现铜介导的核酸酶活性的关键之一 8。 第二、灵菌红素可以破化细胞内的线粒体，高尔基体和溶酶体对细胞质 的 pH 梯度，降低细胞内 ATP 水平 9-10。这是由于灵菌红素可以在这些细胞器的膜上起到离子孔（ Ionophore）的作用，而抵消 H+的同向转运。 第三、灵菌红素可以激活细胞内细胞凋亡途径。一方面，灵菌红素激活前半胱天冬酶 8（ Pro-Caspase 8），继而启动了细胞内半胱天冬酶依赖的细胞凋亡。另一方面，它也可以使线粒体释放其细胞凋亡诱导因子（ Apoptosis
10、 inducing factor，简称 AIF）而触发非半胱天冬酶依赖的细胞凋亡。除此之外，灵菌红素还会通过一系列诱导或抑制的作用达到抑制细胞周期的 目的。另外，根据 Zhang 等研究中，灵菌红素还可以促进细胞集结，阻止癌细胞对周遭组织的入侵或是远端转移 11-12。 在环境治理方面，据韩国科学家对海洋微生物的研究中，发现灵菌红素对消除赤潮有良好的作用 13。这一发现，能有效治理水体由富营养化引起的赤潮，并且是使用生物天然的治理方法，具有高度的安全性，对环境的修复和保持有重大的意义。 在纺织染色方面，灵菌红素染色效果比其他合成色素有优势。钟绵国等对灵菌红素染色的研究，发现灵菌红素比其他染色材
11、料更容易染色，并且染色色度更鲜艳，并且不易洗脱。还有根据灵菌红 素的抗菌性，对被染色的材料还有一定的抑菌性。这在纺织上有很大的发展空间 14。 在食品方面，色素是一种食品添加剂，这直接影响人们的健康。天然色素作为食品添加剂具有较高的安全性，无毒、色泽亮丽诱人，尤其是一些天然色素本身就是人们日常饮食的成分，有一定的营养价值和药理保健作用，备受各界的关注。 1.3.2 生产现状 20 世纪 60 年代早期， Rapoport 等首先描述了灵菌红素化学合成的全过程，但是比较复杂和困难。 1996 年 D Alessio 15等提出了新的制备 PG 类似物的方案，先将 C 环和 B 环相连然后再和A
12、环结合即得 PG 前体物质，步骤简单，合成效率明显提高，但不能成功合成天然的十二烷基 PG。 3 利用化学合成法不能合成纯天然的 PG，因此，人们寄希望于微生物发酵生产，并且，研究多为使用沙雷氏菌发酵生产灵菌红素。 王学东 7对野生黏质沙雷菌株进行紫外诱变处理，筛选获得的链霉素抗性菌株摇瓶产量达到120 mg/L，发酵产量可达 160 mg/L。 Tao 等 16利用紫外诱变获得了一株沙雷菌株 B6，以葡萄糖为初始碳源，流加甘油为灵菌红素合成诱导物，所开发的流加发酵工艺不仅可防止菌体过早自溶，而且可部分消除灵菌红素产 物的抑制作用，将灵菌红素的产量提高了 7.8 倍，达 583mg/L。 We
13、i 等 17-18以改进 LB 培养基，提高胰蛋白胨和酵母膏的浓度并去除了 NaCl 发酵沙雷氏菌生产灵菌红素，约比 LB 增产了 3 倍，达 152mg/L；在培养基中添加 2% 6% 的植物油，如豆油、棕榈油、葵花子油等可促进灵菌红素的合成，最高达 790 mg/L，表明灵菌红素合成与胞外生物表面活性剂的存在有关。 Cang 等从土壤中分离获得一株沙雷菌 S389，以乙醇为唯一碳源，灵菌红素产量最高可达 2.95g/L。 Giri 等 19在黏质沙雷菌的培养 基中分别添加花生籽粉、芝麻粉、咖啡粉，不添加其他物质，均能显著增加灵菌红素产量，其中以添加花生籽粉最为显著，达到 38.75g/L。
14、 Helvia 等 20在沙雷氏菌的培养基中分别添加木薯废水和甘露醇，能显著增加灵菌红素的产量，并大大的降低了生产的成本，并且灵菌红素的产量达到 49.5 g/L。 1.4 实验的目的、内容与难点 本课题所研究探讨的是通过改变沙雷氏菌的培养条件，主要是碳源、氮源的替换来降低灵菌红素的生产成本。其中使用的碳源、氮源均为廉价的农业农作物和工业废弃物，在发酵灵菌红素的过程中产量不稳定，数 据的变动较大。其次，灵菌红素是一种脂溶性的物质，易溶于发酵液中，不易完全提取。因此，如何找到合适的碳源、氮源，如何稳定灵菌红素的生产，有效的提取灵菌红素的本试验的难点，加大了实验的工作强度。 4 2 实验部分 2.
15、1 实验材料 2.1.1 菌种 黏质沙雷氏菌 ( Serratia jx.1)，本实验室保藏。 2.1.2 主要仪器与试剂 HD-930 组合式全温度震荡培养箱 （大仓市博莱特实验仪器厂）； VS-15000CFN II 型小型高速离心机（上海民仪电子有限公司）； VS-1300 型洁净工作台（苏 州时速为净化设备有限公司）； PHS-3C 型精密 pH 计（上海安亨昌吉 149 号雷磁仪器厂）； AL-204 型电子天平（梅特勒 -托利多仪器上海有限公司）； 752s 紫外可见分光光度计 (上海棱光技术有限公司 )； DSX-280A 型不锈钢手提式灭菌器（上海申安医疗器械厂）； LRH-2
16、50A 型生化培养箱 (广东省医疗器械厂）。 本实验所用丙酮、氯化钠、硫酸镁、甘油、乙酸乙酯等均为分析纯； PN5247 蛋白胨、牛肉浸膏等均为生化试剂。 2.1.3 培养基 种子培养基 (g/L)：牛肉膏 3.0，蛋白胨 10.0， NaCl 5.0，琼脂 15， pH 7.4-7.6。 扩大培养基（ g/L）：蛋白胨 13.0，甘油 20.0 Nacl 5.0 摇瓶装液量 20mL/250mL（ V/V） pH 自然。 发酵培养基 (g/L)：蛋白胨 13.0, 甘油 20.0, MgSO4 1.2, NaCl 5.0, Gly 2.0，摇瓶装液量 50 mL/250mL(V/V)，接种量
17、 5 (V/V)， pH 5.7。 2.2 实验方法 2.2.1 种子的培养和优化 种子培养基的配制：按照种子培养基的组成称取牛肉膏 3.0g，蛋白胨 10.0g， NaCl 5.0g，琼脂15g，放到 1000mL 的烧杯中加水至 1000mL，加热搅拌溶解，用 1mol/L 的 HCl 和 1mol/L 的 NaOH调节培养基的 pH，使其在 7.4-7.6。然后分装在 250mL 的摇瓶中，用灭菌锅在 121下灭菌 20min，最后再倒平板。待平板冷却后在无菌条件下，用接种针挑取甘油管中的菌种划平板，放在生化培养箱中， 37培养 12h，即得到活化的沙雷氏菌，将其放于冰箱内保存备用。 2
18、.2.2 种子的扩大培养 5 分别称取（ g/L）蛋白胨 13.0、甘油 20.0、 NaCl 5.0 加入烧杯中加水，搅拌，使烧杯中的物 料都溶解并分装于 250mL 的摇瓶中，每个摇瓶装 50mL 的培养基，并用灭菌锅在 121下高温蒸汽灭菌 20min，待摇瓶内的培养基冷却后在无菌条件下接种，用接种针挑取平板上的单菌落于摇瓶中。接种完后，液体培养 12h，培养温度为 28，转速为 170r/min。 2.2.3 灵菌红素的发酵培养 把扩大培养基中的种子接种于不同的发酵培养基，接种量为 2%。接种完后，液体培养 55h，培养温度为 28，转速为 170r/min。 2.2.3 红色素与菌体
19、的提取 转接后放在摇床里培养 55h 后取出，摇匀，分别用移液枪 移取 1.00mL 发酵液于 1.5mL 离心管中， 4， 12000r/min，离心 10min。弃上清液，然后用移液枪移取 1mL 的丙酮于各个离心管中，用 100 L 枪头搅拌使色素完全溶于丙酮中，再离心，温度为 4， 10000r/min，离心 10min。得到灵菌红素丙酮溶液。若上清液的颜色比较深，取 0.5mL 的上清液放入 10mL 的试管中，加入 1mL的乙酸乙酯，加入食盐，形成过饱和溶液，用盐酸将其调至酸性，然后震荡，将灵菌红素萃取到乙酸乙酯相中。 2.2.4 灵菌红素含量测定 本实验利用灵菌红素在 535nm
20、 波长下具有最 大吸收峰的特性，将提取的灵菌红素丙酮溶液或乙酸乙酯溶液稀释 10-100倍后于 535nm波长下测量吸光度并利用标准曲线方程计算出发酵液中灵菌红素含量。 2.2.5 单因子实验 实验选取不同的碳源、氮源进行单因子实验，其中碳源分别为棉籽柏、菜柏、花生柏、玉米粉、玉米淀粉、小麦粉、山芋淀粉、玉米皮、花生油、芝麻油、麸皮等，用其替代对照培养基中的甘油；氮源为小黄豆粉、黄豆粉、豆柏、豆奶粉、花生粉、豆蛋白粉等，用其代替对照培养基中的氮源，除此之外还有碳源氮源一起替换的为花生粉，芝麻粉，工业废水等，进行对照培养 ，选出对灵菌红素生产影响较大的几种因素，再把被选取的因素各制成不同浓度梯度
21、的实验用培养基。接种后置于 28， 170rpm 摇床中培养 55h，提取后测量吸光度并换算成浓度，比较各因子的显著性，实验平行三次。 碳源、氮源的原料初筛分别见表 2-1，表 2-2；单因素浓度设定见表 2-3。 6 表 2-1 碳源粗筛原料列表 编号 碳源 浓度（ g/L） 1 棉籽粕 20 2 菜粕 20 3 花生粕 20 4 玉米粉 20 5 玉米淀粉 20 6 小麦粉 20 7 山芋淀粉 20 8 玉米皮 20 9 花生油 20 10 芝麻油 20 11 麸皮 20 表 2-2 氮源初筛原料列表 编号 1 2 3 4 5 氮源 小黄豆粉 黄豆粉 豆粕 豆奶粉 豆蛋白粉 浓度（ g/L） 13 13 13 13 13
