1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 高性能淀粉酶菌株的筛选 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 :淀粉酶是重要的工业用酶之一，高活性淀粉酶的生产是产业界的热点。利用选择性培养方式获得淀粉酶高产菌株，并通过对其发酵条 件及酶学性质研究，比较其生产性能。从不同来源的曲中分离筛选到一株较高活性的淀粉酶生产菌株，根据该菌株的培养特征、形态学特征初步鉴定为黑曲霉。该菌株命名为 CH1，在培养基优化后，淀粉酶活性达到 101.686u/mL。其最适反应温度为 60 ，最适反应 pH 为 6.0。该酶在 70 及以下温度内处理 30min，酶活
2、损失不大，具有一定的耐热性，该酶在 pH 值为 5.0 7.0 范围内处理 30min，仍保持高酶活，具有一定的耐酸性。 关键词 : 淀粉酶；分离筛选；发酵条件；酶学性质 II Screening of Strains for the production of high-performance amylase Abstract: This study aims to obtain amylase production strains with high activity and wider ranges of temperatures and pH value. The strain CH1
3、 producing amylase was isolated from daqu, which come from different resource. The strain had high ability to produce amylase According to analysis of the culture characteristics and morphology, the strain could be identified as Aspergillus niger CH1 In optimized condition, amylase activity reached
4、101.686 u/mL. The optimal reaction temperature 60 , the optimum reaction pH 6.0. The enzyme in temperature range from20 to 70 process within 30 minutes, amylase actiity basically unchanged, therefore, has certain heat-resistant, the enzyme in pH range from 5.0 to 7.0 processing within 30 minutes, re
5、main high amylase activity, therefore, has certain acidoresistant. Keywords: amylase; separation and screening; fermentation; enzymology property .1 目 录 摘要 : . I Abstract: . II 1 绪论 . 3 1.1 淀粉酶简介 . 3 1.2 淀粉酶来源 . 3 1.3 淀粉酶的应用 . 4 1.4 淀粉酶的研究进展 . 5 1.5 论文目标 . 7 2 实验部分 . 8 2.1 实验流程 . 8 2.2 分析方法 . 8 2.3
6、实验材料 . 8 2.3.1 样品来源 . 8 2.3.2 实验试剂 . 8 2.3.3 培养基配方 . 9 2.3.4 主要试剂配制 . 9 2.3.5 主要仪器 . 9 2.4 实验方法 . 9 2.4.1 培养基的制备 . 9 2.4.2 产淀粉酶菌株筛选 . 10 2.4.3 菌种的保藏 . 11 2.4.3 菌种形态的初步观察及初步鉴定 . 11 2.4.4 菌种发酵 . 11 2.4.5 淀粉酶活力测定 . 12 2.4.6 发酵过程中不同时间产酶量的测定 . 13 2.4.7 不同碳源、氮源对发酵产酶的影响 . 13 2.4.8 培养基优化 . 13 2.4.9 淀粉酶酶学性质的
7、研究 . 17 2 3.1 淀粉梯度标准曲 线测定 . 18 3.2 菌种筛选结果 . 19 3.3 菌种显微观察结果 . 19 3.4 发酵过程不同时间产酶量的测定结果 . 20 3.5培 养基优化 . 21 3.5.1 碳源对产淀粉酶活力的影响 . 21 3.5.2 氮源对产淀粉酶活力的影响 . 21 3.5.3 正交法优化培养基 . 22 3.6酶学性质研究 . 24 3.6.1 温度对淀粉酶的影响 . 24 3.6.2 pH对淀粉酶的影响 . 25 4 结论 . 27 参考文献 . 28 致 谢 . 错误 !未定义书签。 3 1 绪论 1.1 淀粉酶简介 淀粉酶是催化淀粉、糖原转化成葡
8、萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一类酶的总称，广泛应用于淀粉工业、食品工业、医药、纺织、洗涤剂、青贮饲料、微生态制剂以及酿酒等行业 1。淀粉酶是最早用于工业化生产的酶，迄今为止仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一 2。 不同种类的淀粉酶水解淀粉会生成不同的产物。常见的淀粉酶可以分为以下几种： -淀粉酶（ EC3.2.l.1），也叫液化酶； -淀粉酶（ EC3.2.1.2）；葡萄糖淀粉酶（ EC3.2.1.3），也叫 -淀粉酶，简称糖化酶（缩写 GA 或 G） ； 异淀粉酶（ EC3.2.1.68）等 3。 -淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末
9、端葡萄糖单位碳原子为 构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降； -淀粉酶是从淀粉的非还原性末端切下一分子的麦芽糖，其产物还原性 末端葡萄糖单位碳原子为 构型；葡萄糖淀粉酶是从底物非还原末端依次水解 -l， 4 糖苷键和分支的 -1， 6-糖苷键，生成葡萄糖。异淀粉酶是只水解糖原或支链淀粉分支点的 -1， 6 糖苷键，切下侧枝链 5。 对淀粉酶的分类和作用机制研究较多，可按来源、产物的旋光度、作用机制等进行分类。但近年随着酶学性质的研究的发展，对酶的作用机制、方式等研究不断取得新成果，分类学问题出现许多难点。我国在食品方面研究和应用的微生物酶估计有 30 多种 6，其中淀粉酶有-淀粉酶、 -淀粉酶、
10、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶、普鲁兰酶、 环糊精生成酶等。 1.2 淀粉酶来源 淀粉酶的来源很广泛，可以来自于植物、动物以及微生物。大部分的淀粉酶存在于微生物中，微生物中主要的两种淀粉酶为 -淀粉酶及葡糖淀粉酶，此外，主要存在于植物中的 -淀粉酶也存在于少量微生物中。 -淀粉酶可以从几种细菌、真菌和酵母中分离获得。但是，由于细菌淀粉酶具有几个比较优良的特性，因此，细菌淀粉酶用的比较多，特别是淀粉液化芽孢杆菌已用于工业化生产5。 不像其他的淀粉酶，微生物仅产生少量的 -淀粉酶，有杆菌（假单孢杆菌和梭状芽孢杆菌）等。 葡 糖淀粉酶具有多种来源，植物、动物及微生物，但是，商业上所用的葡糖淀粉酶也是来源于微
11、生物，在所有微生物中，真菌是葡糖淀粉酶的主要来源。 4 1.3 淀粉酶的应用 1.3.1 面包焙烤工业 作为保鲜剂酶应用在焙烤工业中生产各种高品质的产品已经有几百年的历史。最近几十年，麦芽 -淀粉酶和微生物 -淀粉酶被广泛用于焙烤工业。这些酶用于面包工业，使这些产品体积更大，颜色更好，颗粒更柔软。焙烤工业中的 -淀粉酶一直是从大麦麦芽和细菌、真菌中提取的。现代化连续焙烤过程中，在面粉中添加 -淀粉酶不仅可以 增加发酵率、降低生面团黏度，增加生面团中糖的含量，改良面包的口感、外皮颜色和焙烤质量，还可以延长焙烤食品的保鲜时间 7-9。 最近 ， 人们开始关注酶作为防腐剂、保鲜剂在生面团改良方面的作
12、用，如支链淀粉酶和-淀粉酶配合可以有效的用于防腐。然而过量的 -淀粉酶会导致面包过粘。因此，最近的趋势是使用中温稳定 (ITS)-淀粉酶，它们在淀粉液化后活性很高，但在焙烤过程完成前就失活。尽管已发现大量的微生物可以生产 -淀粉酶，但是具有中温稳定性质的 -淀粉酶仅在几种微生物中被发现。 1.3.2 淀粉的液 化作用和糖化作用 -淀粉酶的主要市场是淀粉水解的产物 ， 如葡萄糖和果糖。淀粉被转化为高果糖玉米糖浆。由于它们的高甜度，被用于饮料工业中软饮料的甜味剂。这个液化过程就用到在高温下热稳定性好的 -淀粉酶。 -淀粉酶在淀粉液化上的应用工艺已经相当成熟，已有很多相关报道。 1.3.3 纤维脱浆
13、 现代纤维制造工艺在编织过程中会在纱线中产生大量的细菌，为防止这些纱线断裂，往往会在纱线的表面加一层可去除的保护层。这些表面层的材料有很多种，淀粉是非常好的一个选择。因为它便宜、容易获取，并且可以很容易去除 。淀粉脱浆可以利用 -淀粉酶，它能有选择性地去除淀粉浆而不伤害纱线纤维，还能随机地使淀粉降解为易溶于水的糊精，因而容易被洗掉 7-9。 1.3.4 造纸工业 淀粉酶在造纸工业中的用途主要是改良纸张涂层淀粉。纸张上的浆糊主要是保护纸张在处理过程中免于机械损伤，它同样也改良了成品纸的质量。浆糊提高了纸张的硬度和强度，增强了纸张的可擦除性，是一种很好的纸张涂料。当纸张穿过 2 个轧辊时，淀粉浆被
14、加入纸5 张。这个过程的温度控制在 45 60 ,需要淀粉有稳定的黏度。研磨同样可以根据不同纸张等级控制淀粉的黏 度。自然界的淀粉浓度对于纸张上浆来说太高 ， 可以利用 -淀粉酶部分降解淀粉来调节。 1.3.5 除垢剂中的应用 酶是现代高效除垢剂的成分之一。酶在除垢剂中最大的功能就是使除垢剂更温和无害。早期自动洗碗机的除垢剂非常粗糙，易在进食时对人体造成伤害 ， 而且对陶瓷、木质餐具也会造成损害。 -淀粉酶从 1975 年就被应用于制造洗衣粉。现在， 90%液体除垢剂都含有 -淀粉酶 ， 而且自动洗碗机的除垢剂对 -淀粉酶的需求也在不断增长。 -淀粉酶对 Ca2+过于敏感，在低 Ca2+的环境
15、下稳定性很差，这限制了 -淀粉酶在 除垢剂中的应用 7-9。 1.3.6 制药和临床化学分析 随着生物工程的不断发展 ,淀粉酶的应用涉及到许多其他领域 ,比如临床、制药和分析化学。已有报道 ， 基于 -淀粉酶的液体稳定试剂已应用于全自动生化分析仪 (Ciba Coming Express)临床化学系统，已经建立起一种利用淀粉酶探测更高低聚糖含量的方法。据称，这种方法比硝酸银探测方法更为有效。 1.4 淀粉酶的研究进展 淀粉酶中，尤以 -淀粉酶最为常用，随着社会需求的增大，工业生产对 -淀粉酶的需求量越来越大。 1.4.1 -淀粉酶的催化机理 目前公认的 -淀粉酶的催化机理 9。 10，催化中心
16、位于 / 桶状结构的底部， 261 位谷氨酸和 231 位天冬氨酸是起催化作用的两个重要残基。整个催化过程可分三步：第一步，淀粉链中的糖苷氧被质子供体 261 谷氨酸质子化；第二步，亲核基团 231 位天冬氨酸亲核攻击葡萄糖残基的 C1，糖苷键断裂，葡萄糖残基与 231 位天冬氨酸形成酯键，同时去质子化状态的261 位谷氨酸夺取一个水分子 H+，产生一个 OH-；第三步， OH- 攻击葡萄糖残基的 C1，使酯键断裂， 261 位谷氨酸和 231 位天冬氨酸重新 恢复初始状态。在已知结构的 -淀粉酶中，在 /桶状结构的底部，均含有谷氨酸和天冬氨酸两个残基，它们的相对位置相似，并且所有 -淀粉酶的
17、整体三维结构都很相似，因此，它们的催化反应机理应该是相同或相近的 10。以对 -淀粉酶分子结构和催化机理的研究为基础，通过各种手段改善酶的催化反应特异性，使其更适合于在工业生产中应用是近年来新兴的发展趋势。 6 1.4.2 -淀粉酶的突变研究 目前应用得最广泛的基因水平上的突变主要有两种，即随机突变和定点突变，有时也将两种方法结合使用。随机突变首先需构建突 变文库，然后根据研究酶的特点设计高通量的筛选方法。它的优点是不必明确知道酶的三维结构、催化机理等。定点突变需要对酶的结构机理有较明确的认识，它更适用于研究单个或多个位点对酶分子的影响。将这些方法应用于 -淀粉酶的研究已有一定进展。目前有关突
18、变的研究大多针对于地衣芽胞杆菌活菌，如 Takase研究发现天冬酰胺 326 赖氨酸 /天冬氨酸能够显著改变地衣芽胞杆菌活菌 pH 特性 11。 Nielsen J E 等对地衣芽胞杆菌活菌进行定点突变，发现谷氨酰胺 264 丝氨酸和天冬酰胺 190 苯丙氨酸能提高地衣芽胞杆菌活菌的热稳定性 。 Shaw A 等 12通过随机突变，得到 Met15Thr，能增强地衣芽胞杆菌活菌的稳定性，在此突变的基础上进行随机突变，发现 Met15Thr 和天冬酰胺188 丝氨酸使地衣芽胞杆菌活菌热稳定性提高 2 倍 12。但目前就氨基酸突变如何导致酶宏观性质的改变有待进一步研究。 1.4.3 基因克隆及氨基
19、酸序列 分子生物技术的发展，对 -淀粉酶的研究已进入分子水平阶段，在 -淀粉酶的氨基酸序列分析、基因编码及核苷酸序列分析、基因克隆和基因性状表达等方面都取得较大的进展，基因工程技术已广泛应用到了淀粉酶 生产菌株的克隆上，并且在不同微生物的 -淀粉酶基因克隆方面已经作了大量的工作，主要在大肠杆菌等。 Suganuma 等研究了 -淀粉酶的 N-端氨基酸序列。 Kim 等描述了编码一种新 -淀粉酶的基因，该基因被克隆并在大肠杆菌中表达 13。 Steyn 和 Pretorius 编码 -淀粉酶基因 (AMY)编码 GA 的基因 (STA 2)转入一个酵母菌的整合载体 (Yip5)，形成重组质粒 p
20、SP1 和 pSP2， AMY 和 STA 2 被一同连接到载体 Yip5 中，产生质粒 pSP3。随后，编码抗 Geneticin 418 显性标记 的 A PH 1 被克隆到 pSP3 中得到 pSP4。为了增强 Geneticin 418 的表达， pSP4 再连接启动子 GAL10 和终止子 URA3，这样就得到质粒 pSP5。 pSP5通过增加 ARS1H 和 CEN4序列被修改成环形微染色体 pSP6。转入了 pSP1-pSP6 的实验室郎酒酵母菌株能稳定产多种 -淀粉酶和 GA 14。 1.4.4 国内 -淀粉酶类的生产和应用概况 1965 年 ， 我国开始应用淀粉芽孢杆菌 BF
21、-7658 生产 -淀粉酶 ， 当时只有无锡酶制剂厂独家生产。 1967年杭州怡糖厂实现了应用 -淀 粉酶生产饴糖的新工艺 ， 可以节约麦芽 7% 10%，提高出糖率 10%左右。 1964 年我国开始了酶法水解淀粉生产葡萄糖工艺的研究。 l979 年 9 月7 通过了酶法注射葡萄糖新工艺的鉴定 ， 并先后在华北制药厂、河北东风制药厂、郑州嵩山制药厂等单位得到应用 ， 取得了良好的经济效益。与传统的酸法相比 ， 可以提高收率 10%， 降低成本 15%以上 15。 1.4.5 国外 -淀粉酶研究现状 目前 ， 除开展大量常规诱变育种 T 作外 ,国外已初步搞清产 -淀粉酶的调控基因 ， 探讨了
22、有关转导转化和基因克隆等育种技术。将枯草芽孢杆菌重组体 的基因引入生产菌株 ， 使 -淀粉酶产量提高 7 10 倍 ， 并已应用于食品和制酒工业 ,给选育高产 -淀粉酶菌株开创了新的途径。 1.4.6 国内外研究机构及其主要研究方向 由于 -淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶 ， 国内外很多研究机构对它进行了研究。例如 :四川大学 ， 主要研究 -淀粉酶的生产菌株及其培养条件 ； 江南大学主要研究 -淀粉酶的结构以及应用性能，如耐热性、耐酸性 ;西北大学，主要研究 -淀粉酶的变性机理以及环境对 -淀粉酶的影响 ;华南理工大学，主要研究 -淀粉酶的固定化和动力性质 ;还有华中农业大学、中国科学院沈
23、阳应用生态研究所、天津科技大学、南开大学生命科学学院、中国农业科学院、中国科学院微生物研究所等多家研究机构对多种 -淀粉酶生产菌的 -淀粉酶基因进行了克隆以及表达研究。国外有代表性的研究单位有 ： 加拿大的 University of British Columbia，他们对人胰腺的 -淀粉酶结构和作用机理进行了深入的研究；丹麦的 Carlsberg 实验室主要研究大麦 -淀粉酶结构域与结合位点；美国的 Western Regional Research Center 主要研究大麦的 -淀粉酶与抗菌素的作用以 及大麦 -淀粉酶的活性位点等。 1.5 论文目标 (1) 筛选出产淀粉酶菌株数十株； (2) 筛选出淀粉酶高产菌株一到两株； (3) 菌种的初步分类鉴定； (4) 确定发酵过程中酶的收集时间； (5) 培养基优化，促进产酶； (6) 酶学性质的初步研究。
