1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 高性能淀粉酶菌株的筛选及培养基优化 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 ： 从 土壤 中筛选出 了一株 高产淀粉酶菌株， 通过单因素实验和响应面分析法对该菌株的培养基进行优化，得到最佳的发酵 培养基组成 为：麸皮 19.1g/L，酵母膏 10.4g/L， 豆饼 18.9g/L。在此条件下培养， 酶活 达到 13.88U/mL。 关键词 ： 淀粉酶；筛选；培养基优化 II Strain Screening and Optimization of Fermentation Medium for Hi
2、gher Production of Amylase Abstract:A strain producing amylase was screened from soil.Single-factor experiment and response surface analysis were used to optimize the composition of fermentation medium.The optimal composition of culture medium was as followed:bran 19.1g/L,yeast extract 10.4g/L and s
3、oybean 18.9g/L.Under these conditions,average activity of amylase finally reached 13.88U/mL. Key words:amylase;screening;medium optimization 目 录 摘要 （） Abstract （） 1 绪论 （ 1） 1.1 选题的背景、意义 （ 1） 1.2 -淀粉酶的主要应用 （ 1） 1.3 -淀粉酶的研究现状 （ 3） 2 实验内容 （ 4） 2.1 实验材料 （ 4） 2.2 实验方法 （ 5） 3 实验 结果 （ 7） 3.1 菌株的筛选 （ 7） 3.1
4、.1 初筛 （ 7） 3.1.2 复筛 （ 8） 3.2 培养基优化 （ 8） 3.2.1 单因素实验 （ 8） 3.2.2 PB 重要因素的筛选 （ 10） 3.2.3 中心试验点的确定 （ 11） 3.2.4 响应面实验优化发酵条件 （ 12） 3.2.5 验证实验 （ 13） 4 结论 （ 14） 5 致谢 （ 15） 参考文献 （ 16） 1 1 绪论 1.1 选题的背景和意义 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称， 根据作用的方式可分 为 -淀粉酶 （ EC3.2.1.1.） 和 -淀粉酶 （ EC3.2.1.2.） 1。 其 中 -淀粉酶可从淀粉分子内部切 开 -1,4 -糖苷键 ，
5、生成糊精和还原糖 。 因为产物的末端残基碳原子构型 为 构型 ， 故 称 -淀粉酶 。 -淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物 （ 麦芽、山萮菜 ） 及 微生物。微生物的酶几乎都是分泌 型 的 ，它 以 Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切 断 -1,4 -糖苷键 。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失 ， 最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具 有 -1,6-糖苷键 的 -极限糊精。 -淀粉酶 -淀粉酶的不同点在于 只能 从非还原性
6、末端逐次以麦芽糖为单位切 断 -1,4 -糖苷键 。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等） 。 对于 像 直链淀粉 这类无 分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖 ，而 作用于支链淀粉或葡聚糖的时，切断 至 -1,6-糖苷键前 ，因此生成分子量比较大的极限糊精。 -淀粉酶 被 广泛的应用于食品、酿造、制药、纺织、石油开采等诸多方面。在工业生产中占有极其重要的地位 ,同时它也 是目前用途最广的一种酶制剂 2， 它占了整个酶制剂市场的 25%左右3， 几乎完全替代了化合试剂在淀粉工业中的使用。 1.2 -淀粉酶的主要应用 1.2.1 在淀粉工业中的应用 -淀粉酶用于淀粉工业 ，主要可
7、以 用来生产多孔淀粉 、 淀粉糖等。 -淀粉酶在适宜条件下对 淀粉具有较强的水解能力，可以将淀粉水解成多孔状的多孔淀粉。另外 ， 将 -淀粉酶和其它淀粉酶如糖化酶、普鲁兰酶等协同使用更能提高反应的效率和淀粉成孔的效果 ， 因此现在多孔淀粉的研制多采 用 -淀粉酶和其它酶协同反应 4。而在淀粉糖的生产方面 ，主要作用于淀粉的糖化和液化 。 工业生产中 ， 淀粉的液化是 将 -淀粉酶先混入淀粉乳中 ， 加热 ，待 淀粉糊化后进行液化，可以迅速将淀粉水解成小分子 , 使其粘度降低 , 流动性增高 , 以利于淀粉的糖化 5。 2 1.2.2 在焙烤工业中的应用 -淀粉酶在焙烤食品中的应用已有上百年的历
8、史 。 -淀粉酶用于面 包加工中可以使面包体积增大 、 纹理疏松 ； 提高面团的发酵速度 ； 改善面包心的组织结构 ； 增加内部组织的柔软度 ； 产生良好而稳定的面包外表色泽 ； 提高入炉的急胀性 、 抗老化 ； 改善面包心的弹性和口感 ； 延长面包心储存过程中的保鲜期 6。 目前 ， 焙烤工业使用 的 -淀粉酶主要来自大麦麦芽、真菌和细菌。在面粉中添 加 -淀粉酶不仅能提高发酵速率 ， 而且能降低面团的粘度 ， 从而增加面包的体积 、 提高产品的质地 ， 并且由于 -淀粉酶的存在 ， 面团会产生额外的糖 ， 可以提高面包的风味 、 改善外表的色泽。 1.2.3 在啤酒酿造工业中的应用 啤洒是
9、最早用酶的酿造产 品之一 。 在啤洒酿造中添 加 -淀粉酶使其较快液化以取代一部分麦芽 ， 使辅料增加 、 成本降低 ， 特别是在麦芽糖化能力低，辅助原料使用比例较大的场合 ， 使 用 -淀粉酶 和 -淀粉酶协同麦芽糖化 ， 可以弥补麦芽酶系不足 ， 增加可发酵糖含量 ， 提高麦汁率 、 过滤速度加快 、 提高了浸出物得率 ， 同时又缩短了整体糊化时间。 1.2.4 在纺织工业中的应用 -淀粉酶在 纺织工业中 主要用于织物的退浆。 为了保护棉织物在编织过程中不被破坏，需加入一些浆料。由于淀粉资源广泛 ， 廉价易得 ，且 易退浆 ， 因此纺织工业中多采用淀粉浆作为保护剂。它可以分解淀粉大分子 ，
10、 生成可溶 性的水解产物 ，从而 减弱了对纤维的粘附力 。而 细菌淀粉酶的催化效率相对较高 ，更 有利于提高生产效率。此外，淀粉酶退浆的另一原因是比其它退浆剂 (如酸类 )更利于环保 8。 除以上提到的方面外 ， -淀粉酶在 造纸工业、 酒精工业和清洁剂的生产工业也有广泛的应用 。如 用 -淀粉酶生产了涂布粘合用低粘度 , 高分子量的变性淀粉等等 ， 但是其应用也存在着一定的局限性。如在清洁剂生产工业中由于其对钙离子比较敏感 ， 其稳定性很差 ， 容易失活。最近 ， 世界最大的两家清洁剂酶供应商诺维信和杰能科成功的用蛋白质工程提高了淀粉酶的漂白稳定性。随着诱变 技术的不断进步和菌株优化能力的不
11、断提高 ， -淀粉酶的应用也将更加的广泛。 1.3 -淀粉酶的研究现状 在国外， 现阶段 除了开展大量常规诱变育种工作外，已初步搞清 产 -淀粉酶的调控基因，探讨了有关转导转化和基因克隆等育种技术。将枯草芽孢杆菌重组体的基因引入生产菌株， 使 -淀粉酶产量提高 7 10倍，并已应用于食品和制酒工业，给选育高 产 -淀粉酶菌株开创了新的途3 径。 在国内，自从 1965年， 我国开始应用淀粉芽孢杆菌 BF-7658生 产 -淀粉酶，到 1979年，通过了酸酶法注射葡萄糖新工艺的鉴定，以及到近年来，为了研究 特殊 -淀粉酶，采用各种诱变手段来得到突变菌株等等。在我国 ， -淀粉酶的生产也开始一步步
12、的进入工业化时代了。另外，我国以酶法进行柠檬酸生产、谷氨酸发酵、糖化制啤酒、酒精发酵、黄酒酿造、酱油制造、醋生产等方面也已经研究成功并投入生产。 近年来我国酶制剂工业蓬勃发展，在品种和产量也不断增加，但是同国外酶制剂行业比尚有一定的差距。在国外 ， -淀粉酶 水平达到了 900 U/mL，而高温 -淀粉酶 发酵水平为 300 U/mL，而我国常温 -淀粉酶 活力为 300 500 U/mL，而耐高温 -淀粉酶 活力仅为 150 U/mL，并且我 国 -淀粉酶 剂型、品种和生产菌株都很单一。然而，我国淀粉资源丰富，淀粉酶应用范围广泛，淀粉酶工业发展也必将促进我国其他工业的迅速发展，为适合国民经济
13、发展需要，进一步扩 大 -淀粉酶 的产量和品种已成了一种必然。 4 2 方法与材料 2.1 实验材料 2.1.1 土样来源 嘉兴市金福米业有限公司，绍兴市皋埠镇黄埠村米厂，嘉善酒厂，嘉兴学院食堂。 2.1.2 试剂 碘原液：称取碘 11 克，碘化钾 22 克，加水溶解，稀释至 500 毫升 ，保存于棕色瓶中。 稀碘液：取碘原液 2 毫升，加碘化 钾 20 克，稀释至 500 毫升，此试剂随配随用。 本实验所用 MgSO4 7H2O、 CaCl2、 KH2PO4、 (NH4)2SO4 等均为分析纯；酵母膏为生化试剂 ；玉米粉 、 麸皮 、 豆饼粉 均 为市售 。 2.1.3 主要仪器 ： 型号
14、名称 出厂商 HD-910型 组合式全温度震荡培养箱 大仓市博莱特实验仪器厂 VS-15000CFN II 型 小型高速离心机 上海民仪电子有限公司 VS-1300型 洁净工作台 苏州时速为净化设备有限公司 PHS-3C型 精密 pH计 上海安亨昌吉 149号雷磁仪器厂 AL-204型 电子天平 梅特勒 -托利多仪器上海有限公司 722型 可见分光光度计 上海棱光技术有限公司 DSX-280A 灭菌锅 上海宜川仪表厂 LRH-250A型 生化培养箱 广东省医疗器械厂 比色管、秒表、水浴锅、 烧杯 、 接种针 、 铝锅 、 玻璃棒 、 250mL 锥形瓶 、 标签纸 、容量瓶、酒精灯 、 石棉网
15、 、粉碎机 、移液管 、移液枪、 量筒 等 。 2.1.2 培养基及培养条件 2.1.2.1 筛选培养基 ： 可溶性淀粉 10g，蛋白胨 5g， NaCl 5g， 琼脂 20g，蒸馏水 1000mL， pH7.0。 2.1.2.2 发 酵出发培养基 ： 可溶性淀粉 5g，玉米粉 10g，豆饼 30g， MgSO47H2O 2g， KH2PO4 8g， (NH4)2SO4 4g， NaCl 4g， 蒸馏水 1000mL， pH 自然。上述所有培养基都在 121灭菌 20min。 2.1.2.3 培养条件 ： 250 mL 锥形瓶中装入发酵培养基 50 mL，以 1%的接种量接入种龄 24 h 的
16、种子， 37， 150 r/min5 振荡培养 48 h。 2.2 实验 方法 2.2.1 菌株的筛选 ： 2.2.1.1 初筛： 制备土壤菌悬液，并通过梯度稀释获得 10-110-8 的不 同浓度的菌悬液，取 10-5 至 10-8 菌悬液各 0.3mL 均匀涂布于淀粉平板，放于 37恒温培养。 1d2d 后挑取形态不同的单菌落，通过划线分离进行初步纯化，滴加碘液测量水解圈直径与菌落直径的比值大小即 D/d 值 9， 将 D/d 值大的菌落进行划线分离。将具有良好酶活性的菌株作为复筛的出发菌种，对其进行发酵培养，并通过国标 法测定发酵液酶活，以确定稳定的高产淀粉酶菌株 2.2.1.2 摇瓶复
17、筛 ： 将初筛得到的菌株作为复筛的出发菌种，接入装液量为 20%的 250mL 的锥形瓶中，放入 37，150r/min 的摇床对其进 行发酵培养，测定发酵液酶活 ， 每隔 8h 测定一次，比较酶活 以确定稳定的高产淀粉酶菌株。 2.2.2 淀粉酶液分离： 将发酵液 摇匀，用移液枪移取 2.00mL 发酵液于 2mL 离心管中， 4000r/min，离心 10min， 取上清液做为淀粉酶液。 2.2.3 淀粉酶活的测定 10： (1)准确吸取酶液 1.00mL，用少量磷酸缓冲液（ pH=6.0）溶解，配制 n 倍稀释倍数的酶液。 (2)吸取 20.00mL 的 2%可溶性淀粉溶液于试管中，加入
18、磷酸缓冲液 5.00mL，摇匀后，置于 60恒温水浴中预热 8min。 (3) 加入 1.00mL 稀 释好的待测酶液，立即记时，摇匀，准确反应 5min。 (4) 待反应 5min 后立即吸取 1.00mL 的反应液，加到预先盛有的 0.5mL 的 0.1mol/LHCl 和5.00mL 的稀碘液的试管中，摇匀，并以 0.5mL 的盐酸溶液和 5.00mL 的稀碘液为空白，于 660nm下，用 10mm 比色皿迅速测定其吸光度（ A）。 酶活力单位定义 ： 在 pH6.0， 温度 60 ， 1h水解可溶性淀粉 lg所需的酶量为 1个酶活力单位 (U)。 (5)酶活力的计算公式 ： X1= C
19、 n 其中 ： X1为样品的酶活力， U/mL； C为测试样液溶度， U/mL； n为稀释倍数。 2.2.4 培养基 优化： 6 2.2.4.1 单因素优化： 以发酵出发培养基为基础，对培养基碳源、氮源、无机盐、发酵液初始 pH 等培养基组分及发酵工艺条件进行单因素实验。进行单因素实验时，只改变所考察的因子，其他条件不变 。发酵在 250mL 摇瓶中完成，装液量为摇瓶标定容量的 20，将已培养 l2-16h 的菌种以 4%的接种量接入，然后在 37， 150r/min 的摇床上培养 48h。 2.2.4.2 Plackett-Burman（ PB）设计： 采用单因素试验对 YD-1 的发酵培养
20、基分别对碳源、 氮源、磷源等组分进行筛选和水平优化研究 ， 以对 YD-1 的培养液淀粉酶活性高和生物量大为依据 ， 筛选确定几个因素和其对应的最优水平。采用 Plackett-Burman（ PB） 实验设计 ， 每个因素取高低两种水平，试验结果以生物量为响应值 ， 选择可信度大于 90%的因素作为响应面设计的变量 ， 最终筛选出对生物产酶量促进明显的主要因素 11。 2.2.4.3 最陡爬坡实验： 响应面拟合方程只在考察的紧接领域里才充分近似真实情形，要先逼近最大响应区域后才能建立有效的响应面拟合方程。最陡爬坡法根据各显著因素效应值的大小来确定最陡 上升路径， 而其他因素的取值则根据各因素效应的正负和大小，正效应的因素均取较高值，负效应的因素均取较低 值 12。 2.2.4.4 Box-Behnken 响应面分析： Box-Behnken 提出的中心组合设计适用于 2 至 5 个因素的优化设计和试验 ， 通过 2 水平试验设计得到的三个重要因素 ， 根据 Box-Behnken 的中心组合实验设计原理 ， 进一步进行 3 因素 3水平的响应面分析试验 ， 然后运用 SAS 的 RSREG(响应面回归 )过程 ， 建立次响应面回归模型 ，并对拟合的回归方程分析决最优工艺参数 ， 确定最优响应因子水平 13-15。
