1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 红色素的稳定性研究 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要： 以 细菌的次级代谢产物红色素为研究对象，通过 核磁共振 ，判断 此红色素就是 灵菌红素 。本文 分别从光照、温度 、 pH等方面 ， 系统 考察了红 色素 在甲醇和乙醇溶液中 的稳定性 。 实验结果表明：该色素属于脂溶性色素，易溶于甲醇和丙酮，不溶于水 。该色素 对温度稳定，在低于100 下 ， 色素溶液无明显变化 。 但受 pH的影响较大，酸性环境中能保持较长的时间，碱性条件下则损失较大 ， 日光 直射 引起色素溶液褪色。 关键词 ：
2、灵菌红素；理化性质；稳定性 II Abstract: The red pigment as secondary metabolites of bacterium was studied, and the red pigment was judged as prodigiosin by analysis of NMR. This paper systematically investigated red pigment in methanol and ethanol solution of stability respectively from the light, temperature, p
3、H, and so on.The results showed that this pigment belongs to fat-soluble pigment. under less than 100 , this pigment is stability. But different pH value would cause the great change of the pigment. The pigment with higher stability in the acidic environment than in alkaline conditions, however the
4、pigment is instable under direct light. Key words: prodigiosins； physical and chemical properties； stability目 录 摘要 . I Abstract. . II 1 绪论 . 1 1.1 灵菌红素的结构与性能 . 1 1.2 最新研究动态 . 2 1.2.1 PG 的抗肿瘤作用 . 2 1.2.2 免疫抑制剂活性 . 2 1.2.3 抗菌作用 . 3 1.2.4 抗疟疾活性 . 3 1.3 本论文的研究意义、目标及内容 . 3 1.3.1 本论文的研究意义 . 4 1.3.2 本论文研究目
5、标和内容 . 4 2 实验部分 . 5 2.1 实验材料、药品和仪器 . 5 2.1.1 材料 . 5 2.1.2 药品与仪器 . 5 2.2 灵菌红素的发酵提取 . 5 2.2.1 操作流程 . 5 2.3 灵菌红素的稳定性研究 . 6 2.3.1 色素的溶解性 . 6 2.3.2 色素的吸收光谱 . 6 2.3.3 光照对色素稳定性影响 . 6 2.3.4 温度对色素稳定性影响 . 6 2.3.5 pH 值对色素稳定性影响 . 6 3 结果与分析 . 7 3.1 灵菌红素的发酵提取 . 7 3.2 灵菌红素的稳定性研究 . 7 3.2.1 色素的溶解性 . 7 3.2.2 色素的吸收光谱
6、. 8 3.2.3 光照对色素稳定性影响 . 10 3.2.4 温度对色素稳定性影响 . 12 3.2.5 pH 对色素稳定性影响 . 13 4 结论 . 14 参考文献 . 17 致 谢 . 19 1 1 绪论 色素分为人工合成色素和天然色素两大类，在实际生活中应用广泛。 随着毒理学 和分析技术的不断发展 ， 合成色素对人体健康的危害越来越引人注目 ， 有的还有致癌作用 ， 因此合成色素作为食品添加剂的用量越来越少 ， 甚至 还 被 很 多国家禁止使 1。而天然色素作为食品添加剂具有较高的安全性 ， 无毒、色泽亮丽诱人 等优点 ， 尤其是一些天然色素本身就是人们日常饮食的成分 ，有一定的营养
7、价值和药理保健作用 ， 因此倍受人们的瞩目 2。 例如 天然色素如 -胡萝卜素是人体必需的营养物质 ， 又如黄酮类天然色素 ， 同时具有一定的药理作用。随着加工行业的发展 ， 色素的应用也随之不断扩大 ， 对天然色素的需求 也 在不断的提高。 因而，现在利用无毒 无害的天然物质提取食用和化妆品用色素，成为新的发展趋势。 目前天然色素的获得主要有 3 条途径 3：一是直接提取 ； 二是人工合成 ； 三是利用生物技术 生 产。但前两者受到资源和环境等多种因素的限制。近年来随着生物技术的发展 ， 利用生物技术生产天然色素为人们开辟了广阔的领域。通过微生物资源发酵生产红曲色素、类胡萝卜素等多种天然色素
8、已成为现实 4-5。 1.1 灵菌红素的结构与性能 灵菌红素 (prodigiosins， PG)是一类天然红色素的总称，通常都有 3 个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构， 是由一些放线菌、沙雷氏菌及其它 细菌产生的次级代谢产物，具有抗细菌、抗真菌、抗疟疾、免疫抑制和抗肿瘤等活性 ， 因此备受学者关注 6。 目前已有通过化学合成灵菌红素的报道 ， 但由于化学合成工艺的复杂性等多种因素的限制 ， 至今尚未能进行大规模的生产 ， 灵菌红素这一具有极高应用价值的活性成分各方面的研究及应用都受到极大的限制。通过分子生物学方法改善微生物菌株的生产性能以及对其发酵工艺的研究 ， 由微生物发酵法生产灵菌红素
9、， 是解决灵菌红素来源的局限性的有效途径之一。 灵菌红素化学结构式如图 1 所示 。 NO M eNH NHC 5 H 1 1M e图 1 灵菌红素化学结构式 PG属于脂溶性色素，易溶于甲醇和丙酮，不溶于水，在极性较强的酸性和碱性水溶液中微溶，在极性较弱的有机溶剂如乙醚或石油醚中微溶或不溶； PG对温度稳定，但受 pH的影响较大，酸性环境中能保持较长的时间，碱性条件下则损失较大； A1， Ca， K ， Ba 等金属离子对 PG的稳定性2 影响不大， Zn 有使 PG增色的作用， Mg 和 Mn 对 PG有一定的破坏作用， Pb 可以络合 PG，使之成为沉淀 ；白光和蓝光使 PG发生光解，在红
10、光和远红光下 PG则不会降解 6。 1.2 最新研究动态 1.2.1 PG的抗肿瘤作用 Montaner等 7的研究 结果 表明，人结肠腺癌细胞株 DLD-1、 SW-620、 人胃癌细胞株 HGT-1的凋亡 可以通过 PG诱导 ， 而且 PG对转移性肿瘤细胞株 SW-620更 加 有效，其诱导结肠癌细胞凋亡主要表现为细胞收缩、染色质缩合、肌动蛋白微丝结构重组等 ，并 呈剂量依赖性，。目前对 PG的抗肿瘤作用机制 还 不 是完全 清楚， Montaner等认为， PG通过诱导 p38-MAP激酶（ p38-MAPK）的磷酸化而使细胞凋亡。 Songia等 9则认为， PG通过抑制视网膜母细胞瘤
11、易感基因（ retinblastoma， Rb）的磷酸化作用与抑制细胞周期蛋白酶 2和 4（ Cdk-2， Cdk-4）阻滞人 的 淋巴细胞增殖。 Yamamoto等 10将 PG的抗肿瘤作用归因于能促使 H+和 Cl-的同向跨膜转移， 然后使 空泡型H+/-ATP酶（ VATPase）解离， 最终使 胞液酸化引起凋亡。 Castillovila等 11对 PG对结肠癌细胞溶酶体内 pH值及细胞繁殖周期的影响 进行研究 ，结果支持了 Yamamoto等胞液酸化从而引起凋亡的观点。但 这个 观点 也 备受争论，其焦点是胞液酸化在细胞凋亡中能起多大作用。 Melvin等 12用显 微荧光技术研究
12、PG对 DNA的结合作用，用琼脂糖凝胶电泳研究了 PG对铜离子诱导的 DNA 裂解的作用。认为， PG富含电子而被氧化并还原 Cu2+，引发铜离子诱导的双链 DNA裂解，表现出细胞毒活性 ， 对肿瘤细胞的杀灭作用与其核酸酶特性相关。 Subramanian等 实验 13从微球菌（ Micrococcus sp.）分离出 的 PG结构类似物具有核酸酶特性及抗肿瘤活性， 这个 化合物可以 有效地 和 DNA结合，并促进铜离子介导的 DNA裂解 与 膜脂质过氧化，对鼠源淋巴瘤细胞株 EL4和人源慢性骨髓瘤细胞株 K562有显著的细胞毒活性，抑 制瘤细胞的增殖。 不同结构的 PG 细胞毒特性也不同。如
13、果用芳烃类物质代替母体结构中的 A 环或 B 环，会导致PG 类物质诱导 DNA 断裂的活性大部分或完全丧失 9-12； PGC-6 甲氧基被更长的烷氧基取代时，活性会下降。根据这些研究成果进行的分子改造形成了新的 PG 衍生物，活性指数比母体分子还要高出数倍 13。 1.2.2 免疫抑制剂活性 选择性免疫抑制包括临床器官移植中能抑制信号传递 与 在自体免疫性疾病治疗，预防 T细胞激活。药物 rapamycin， FK506， cyclosporin A（ CsA/CyA）是 目前 器官移植 与治疗 自体免疫性疾病常用药物 14，这些药物 毒性很大 。 PG的免疫抑制活性与上述药物的作用机制
14、完全不同 ，竞争性对抗研究表明， PG与受体细胞的结合位点 和 CyA， FK506及 rapamycin的通常结合位点 都不同 。临3 床上将 PG与 CyA结合用于解除器官移植急性排斥反应，效果 很 好 15，对其潜伏期和临床应用 还 有待进一步研究。 PG不抑制白介素 2分泌，但通过抑制 IL-2的信号转换而阻断其生物活性。研究表明，PG色素抑制磷酸化并激活细胞质酪氨酸激酶 JAK-3，与细胞表面受体 common -chain结合，阻断common -chain的信号转换功能从而表现出特效的免疫抑制活性 16。 PG能显著抑制由多克隆丝裂原 PHA和 PWM刺激的人源 T淋巴细胞及 B
15、淋巴细胞的增殖，还能促使伴刀豆球蛋白刺激的脾细胞凋亡，但对脂多糖刺激的脾细胞增殖无抑制作用 ， 只有浓度较高时对脂多糖刺激的鼠源 B淋巴细胞有抑制作用。表明此化合物能选择性地抑制 T淋巴细胞增殖，同时可诱导人源 T淋巴细胞株 Jurkat cells发生凋亡，以及抑制氢离子迁移 17,18。 10 30mg/kg 的 剂量 为 PG抑制 T 淋巴细胞介导免疫反应的有效剂量 ， 而且此 剂量对淋巴器官没有毒性 。 因而， PG是一种潜在的新型免疫抑制药物。 但由于灵菌红素的细胞毒性，目前作为免疫抑制药物仍然受到限制。不过以灵菌红素化合物作为基本骨架结构，寻找免疫抑制活性强、毒副作用低的衍生物有较
16、好的前景，因而备受关注。 1.2.3 抗菌作用 灵菌红素最初是作为一种抗菌物质被研究的，其具有抗细菌、抗真菌的生物活性。灵菌红素的体外抑菌试验表明，其对金葡菌 (耐青霉素、红霉素菌株 )和弗氏志贺菌有很好的抑制效果 21。Cang等 20以沙雷菌发酵生产的 PG做抗菌实验，结果表明，对芽孢杆菌具有显 著地杀灭作用。 PG结构类似物具有显著的抗 Trichophytonspn等真菌的活性 21，在临床测试中表现出对由球孢子菌引 起的一种地方性真菌传染病有良好的治愈作用 22。但由于灵菌红素制备困难，其抗菌活性还有待进一 步研究。 1.2.4 抗疟疾活性 Isaka等 21从 Streptomyc
17、es spectabilis BCC 4785的发酵产物中分离得到的 MP有显著的抗疟疾活性。 虽然 多种 PG类似物在动物模型中表现出了抗疟疾活性，但由于可 以 获得的 PG产量有限 ，故 对其抗菌、抗疟疾和抗原生动物等的作用机制 有待进一步研究。此外， PG能保护海洋细菌免遭太阳辐射损害或原生动物侵蚀，具有 Dinoflagellates的活性 23， PG对引起查格斯疾病的锥虫（一种寄生虫）有很大的杀伤作用，其杀锥虫活性是经典杀锥虫药 Nifurtimox活性的 30倍。 Botrytis cinerea等引起的樱草属植物 的 病害 ，可以用 PG做农药进行有效的防治 。 PG具有强烈的
18、细胞溶解酶活性，能杀灭引起赤潮的浮游藻类 24， 1/10的浓度 1h就能杀灭导致赤潮的大部分浮游生物。 PG有望成为治理赤潮的产品。微生物发酵生产的天然色素 PG用于食品 工业还是比较理想的。 1.3 本论文的研究意义、目标及内容 1.3.1 本论文的研究意义 4 目前在我国的天然红色素中 ， 从植物中提取的红色素占市场主导地位 ， 但阻碍植物红色素发展的一个原因就是植物的生长周期比较长 ， 而且提取工艺比较复杂 ， 给天然红色素的数量及质量带来了很大的影响。利用微生物发酵生产天然红色素很好地解决了这个问题 。 微生物的生长周期一般为 1d 3d， 而且不受环境因素的影响 ， 提取工艺比较简
19、单 ， 产品质量能够保证。 灵菌红素是一类天然色素 ， 具有吡咯环结构 ， 主要包括 prodigiosin、 nonylprodigiosin、 cyononylprodiginine 和metacycloprodigiosin 等。灵菌红素具有一定的免疫活性 ， 如抑制 细 菌、 霉 菌和 真 菌等功效 ， 且具有一定的抗肿瘤作用，因此具有很大的药用价值。 同时 也可以作为饲料添加剂，食品添加剂以及织物染色，非常具有开发前景。 本论文分别从 溶解性、光照、温度、 pH等 对红色素稳定性的影响，探究最适的理化条件，为色素开发提供足够的基础依据。 1.3.2 本论文研究目标和内容 研究目标 在
20、不同溶剂中 对红色素稳定性进行系统的测试、观察和比较，以便为饲料添加剂、纺织染 色和食品等领域提供研究依据。 研究内容 （ 1）红 色 素的发酵分离提取； （ 2）分别从 溶解性、光照、温度、 pH 等 对红色素稳定性的影响。 5 2 实验部分 2.1 实验材料、药品和仪器 2.1.1 材料 红 色 素，从土壤中筛选得到的一株产红色素细菌的次级代谢产物。 2.1.2 药品与仪器 氯化钠、 甲醇 、丙酮、无水乙醇、 氢氧化钠 、 盐酸 、乙酸乙酯均为分析纯；蛋白胨、牛肉膏购于 生工生物工程（上海）有限公司。 仪器见表 1。 表 1 主要仪器及设备 仪器名称 及型号 制造商及产地 722S可见分光
21、光度计 上海凌光技术 有限公司 立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 TH2-C 恒温振荡器 江苏太仓市实验设备厂 BIOFLO 110型实验室自控发酵罐 新布伦兹威克科学公司 A1204 电子天平 梅特勒 -托利多仪器有限公司 TDSA-WS 台式低速自动平衡离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司 LRH-250-A 生化培养箱 广东医疗器械厂 DK-S24型恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司 UV2550 紫外可见分光光度计 岛津公司 核磁共振波谱仪 ADVANCE400M Varian公司 2.2 红色素的发酵提取 经实验得知，红色素为 脂溶性 ，易溶于乙醇，丙酮等有机溶剂中。考虑到溶剂的经济性， 故决定用 pH3的 丙酮作为浸提溶剂。 2.2.1 操作流程 平板活化 种子培养 一级发酵培养 二级发酵培养 离心 干燥 粉末 平板活化 ： 从保藏菌种的试管中挑取菌落到事先倒好的平板进行划线培养 12小时，温度 37 。 种子培养 ： 挑取平板上单个菌落转接到摇瓶培养 12小时，温度 27 ，转速 150r/min。
