1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 快速显色法筛选白蔹酯提物抗菌活性 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘 要 ： 本课题 的主要目的是通过快速测试白蔹乙酸乙酯提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能，建立定性及定量 的测试方法，得到白蔹乙酸乙酯提取物抗菌性能的具体数据，为开发功能性中药材提供理论和实验基础。 以快速显色法测定白蔹酯提物抗菌活性 ， 该测定方法以 MTT 为指示剂在 96 孔板上进行操作， 经测试证明 白蔹乙酸乙酯提取物对 大肠杆菌和 金黄色葡萄球菌 均具有一定的抗菌活性。 大肠杆菌对 浓度为 100mg/ml 的
2、白蔹乙酸乙酯提物 敏 感 。 对 浓度为 25mg/ml 的 白蔹乙酸乙酯提物 耐药。 金黄色葡萄球菌 对 浓度为 50mg/ml 的 白蔹乙酸乙酯提物 敏 感 。 对 浓度为 6.25mg/ml 的 白蔹乙酸乙酯提物 耐药。 关键词 :快速显色法；酯提物；白蔹；抗菌 活性； II Rapid Screening of color acetate extract of Ampelopsis antibacterial activity Abstract :The main purpose of this project is to test Ampelopsis japonica Ethyl
3、acetate extracts antibacterial properties of Escherichia coli and Staphylococcus aureus, establish the qualitative and quantitative testing methods, and get the specific data of the ampelopsis Ethyl acetate extract antibacterial properties providing the development of functional medicines for theore
4、tical and experimental basis. Determination of a fast color acetate extract of ampelopsis antibacterial activity, The method is use MTT as an indicator on the 96Orifice. Has been tested and Ampelopsis ethyl acetate of S. aureus, E. coli showed some antibacterial activity. E. coli sensitive to the co
5、ncentration of 100mg/ml of the ethyl acetate extract of ampelopsis,Resistance on the concentration of 25mg/ml of the ethyl acetate extract of Ampelopsis. S. aureus sensitive to the concentration of 50mg/ml of the ethyl acetate extract of Ampelopsis,Resistance on the concentration of 6.25mg/ml of the
6、 ethyl acetate extract of Ampelopsis. Keywords : Fast Color method； Acetate extract； Ampelopsis japonica； antibacterial activity 目 录 摘 要 .（） ABSTRACT.（ ） 1 绪论 .1 1.1 选题的背景、意义 .1 1.2 植物提取 物的抗菌活性 .1 1.2.1 植物提取物的体外抑菌作用机制 .1 1.2.2 抗菌性能及其检测 .1 1.2.3 植物提取物 抗菌优势 .2 1.2.4 抗菌检测 MTT 法 .3 1.3 白蔹简介 .3 1.3.1 白蔹的
7、化学成分 .3 1.3.2 白蔹的抗菌活性 .4 2 实验内容 . 5 2.1 实验流程 . 5 2.2 分析方法 . 5 2.3 实验内容 . 6 2.3.1 实验器材： . 6 2.3.2 实验步骤： . 7 3 结果与分析 . 9 3.1 抗菌实验结果及分析 . 10 3.2 吸光度测定及结果分析 . 10 4 结论与讨论 . 11 5 致谢 .14 参考文献 . 14 1 1 绪论 1.1 选题的背景、意义 抗菌药物是现代医疗中不可缺少的一大类药品，临床应用十分广泛。但是，目前在应用这类药物时存在着许多问题，如毒副反应、变态反应、细菌耐药性的产生等 ，尤其是细菌耐药性的迅速上升，使得由
8、这类病菌所致的严重感染没有有效的药物可供选用，对人类健康造成极大的威胁。由于中草药的特殊性，细菌较少对中草药产生耐药 1。因此，研究和开发抗菌中药对解决耐药菌株的产生和抗生素短缺问题具有重要意义。近年来，从天然资源中寻找新的抗菌活性的药物成为目前研究中的一个热点。由于植物资源很庞大，其次生代谢物众多，采用传统的筛选方法从中筛选具有抗菌活性的组分 (成分 )费时而低效并且消耗很大。本研究以噻唑蓝为指示剂，运用一种快速的显色方法来筛选白蔹粗提物的抗菌活性，从而为快速寻找新的抗生 素类药物的提供一个新的方法。 1.2 植物提取物的抗菌活性 人类自从古代就记载了许多具有杀虫或控制害虫、抗菌或杀菌作用的
9、植物 , 如中国、印度等东南亚以及一些非洲国家的劳动人民积累了许多利用植物杀虫防病的经验。几个世纪前 , 我国人民就已知道植物中含有抗菌物质 , 在许多实例中 ,这些化合物能以天然的抗性或防御体系来抵抗微生物或其他病害。某些化合物具有特殊味道或气味 , 已经在香料工业中使用 , 使用药草和香料作为调味品或食品防腐剂 , 许多文献已报道了它们的特性及活性成分 23。 植物源抗菌物质在自然界中广泛存在 ,是绿色杀菌剂创制的重要先导源。植物体内的抗菌化合物是植物体产生的多种具有抗菌活性的次生代谢产物包含了生物碱类、类黄酮类、蛋白质类、有机酸类和酚类化合物等许多不同的类型。曾有人报道过 1389 种植
10、物有可能作为杀菌剂。中药在防治疾病上作用 , 是以调动机体一切有利因素 , 调动机体的反应性、提高免疫功能和防御功能而法除病邪 , 康复机体。抗菌中药作用机理也是如此 , 少数是其有效成分直接作用于菌体 , 大多数抗菌机理是激发调动动物机体内在的抗菌积极因素 , 以及降低细菌毒力和减轻细菌对组织细胞的破坏作用等途径起到抗菌作用。 4 1.2.1 植物提取物的体外抑菌作用机制 目前，植物提取物添加剂的抗菌作用机制仍没有彻底明了。由于植物提取物所用的植物种类繁多，其活性成分也很多，因此，植物提取物添加剂抗菌机制可能有多种机制。这些作用机制包括 : (1)干扰细胞壁的合成。细菌细胞壁的重要组分为肽聚
11、糖 ,抗菌剂对细胞壁的干扰作用 ,主要2 是抑制多糖链与四肽交联的连结 ,从而使细胞壁失去完整性和对渗透压的保护作用 ,损害菌体而死亡。 (2)可损伤细胞膜。细胞膜是细菌细胞生命活动的重要结构部分 ,因此当细胞膜受损伤、破 坏时 ,将导致细菌死亡。 (3)抑制蛋白质的合成。蛋白质的合成需要活化的氨基酸 ,且在各种酶参与下在核糖体上完成。抑制、阻碍和改变其中任何一组结构或其合成环节之一 ,都能导 致蛋白质合成过程 变更、停止 ,使细菌死亡。 (4)干扰核酸的合成。总的说是阻碍遗传信息的复制 ,包括 DNA、 RNA 的合成以及按 DNA 模板转录 mRNA 等。 1.2.2 抗菌性能及其检测 抗
12、菌性是衡量抗菌剂性能的重要指标 ,科学的测试评价方法是客观反映抗菌性测定结果的关键。应根据抗菌剂的亲 (疏 )水性、所用抗菌剂的溶出 性及其外在形态使用相应的测试方法。在抗菌剂应用中 ,抗菌性能是材料和制品的特殊功能 ,要求高效、广谱、长效、安全、耐热耐光 ,在相关环境中适用。抗菌性能的检测属微生物试验范围。 1.2.3 植物提取物 抗菌优势 抗菌植物资源开发利用是一项多学科渗透的综合性很强的课题 因此应积极引进新技术加强多学科综合性的研究 ,由于植物的抗菌特性具有广谱性 ,它的利用领域就较宽广 ,因而 ,就应该做到物尽其用 ,让它发挥应有的作用。如江西的草珊瑚资源十分丰富 ,最初人们根据它的
13、抗菌特性 ,研制了抗菌消炎的药品草珊瑚含片 ,以后又相继开发 了 日用品草珊瑚牙膏。近年 ,江西又推出了保健食品草珊瑚口香糖。由于江西的草珊瑚资源得到了较合理的应用 ,生产厂家仅利用此一项资源每年就为国家上交利税超亿元。随着世界新技术革命的到来 ,抗菌植物资源的利用必然首先会受到生物工程、食品工程、电子计算机等学科先进技术的影响 ,运用细胞融合、杂交技术来进行抗菌植物的良种选育 ,能产生出许多在产量和质量上都较传统方法更好的新品种 5。 1.2.4 抗菌检测 MTT 法 MTT 法又称 MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为
14、水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（ Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（ DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内， MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。 3 1.3 白蔹简介 白蔹（ Ampelopsis japonica），也称山地瓜、猫儿卵、鹅抱蛋、见肿消、穿山老鼠，为葡萄科、蛇葡萄属多年生半木质藤本攀援植物。白蔹是近年新开发原产我国的块茎类多肉植物，藤茎细长，叶片秀丽，群生的块茎古朴苍劲，给人以清新自然 、颇具野趣的感觉，或地栽于庭院假山、篱笆旁，或盆栽陈设于阳台、厅堂等处均宜。其块
15、茎经加工后，具有清热解毒、消痈散结、生肌止痛等功效，可用于痈肿疮疡、扭挫伤、烫伤等治疗 6。 临床报道白蔹用于治疗化脓性皮肤感染、 细菌性痢疾等疾病 , 疗效显著 7。现代研究表明 ,白蔹含有大黄素甲醚、 大黄酚、大黄素、富马酸、没食子酸等多种抗细菌和抗真菌成分 ,与其临床应用相一致 8。 1.3.1 白蔹的化学成分 （ 1）多酚类 多酚类是白蔹的主要化学成分，也是其主要活性物质。俞文胜等 9用 Sephadex LH-20 柱层析从白蔹的乙酸乙酯提取物中分离得到一系列多酚类化合物，包括没食子酸， 1,2,6-三氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖， 1,2,3,6-四氧 -没食子酰基 -
16、-D-吡喃葡萄糖， 1,2,4,6-四氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖， 1,2,3,4,6-五氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖，二聚没食子酸， 1,4,6-三氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖， 2,4,6-三氧 -没食子酰基 -D-吡喃葡萄糖， 2,3,4,6-四氧 -没食子酰基 -D-吡喃葡萄糖， 6-氧 -二聚没食子酰基 -1,2,3-三氧 -没食子酰基 - -D-吡 喃葡萄糖，槲皮素 -3-氧 - -L-吡喃鼠李糖，槲皮素 -3-氧 -(2-氧 -没食子酰基 )- -L-吡喃鼠李糖。这些多酚类物质有的具有较强的抗脂质过氧化活性，有的具有很强的抗毒肝素活性。郭丽冰等 1
17、0从白蔹乙醇提取物的三氯甲烷中首次分离得到槲皮素。 （ 2）有机酸类 郭丽冰等用硅胶柱层析从白蔹的乙醇提取物中分离得到脂肪酸三十烷酸和二十八烷酸。邹济高 11分离得到十六烷酸和富马酸。此外，白蔹还含有酒石酸，龙脑酸等。 （ 3）三萜、甾醇及其苷类 郭丽冰等用硅胶柱层析从白蔹乙醇浸膏的乙酸乙酯提取物中分离得到 -谷甾醇、豆甾醇和豆甾醇- -D-葡萄糖苷。邹济高等分离得到羽扇豆醇。 （ 4）其他 白蔹中的蒽醌类主要有大黄素甲醚、大黄酚和大黄素等 12。 Lee 等 13用活性追踪法，从白蔹的甲醇提取物中分离得到具有抗肿瘤活性的 momordins，包括 momordin I， Id 和 Ie。白蔹
18、中还4 含有卫茅醇、淀粉和黏液质等。 1.3.2 白蔹的抗菌活性 抗菌是白蔹的主要活性，目前研究的较多。白蔹含有大黄素甲醚、大黄酚、大黄素、富马酸、没食子酸等多种抗细菌和真菌成分，与其临床应用相一致。白蔹的水浸液对同心性毛癣 菌、奥杜盎氏小芽胞癣菌、腹股沟和红色表皮癣菌等真菌有不同程度的抑制作用。水煎剂用平板稀释法对金黄色葡萄球菌有抑制作用。 闵凡印等 14将白蔹生药、炒黄品、炒焦品分别水煎醇沉，用纸片法抑菌环实验检测沉淀物和醇溶液部分的抑菌作用。沉淀物中仅炒黄、炒焦品对金黄色葡萄球菌有抗菌作用， 醇溶液则对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、福氏痢疾杆菌、大肠杆菌有明显抑菌作用。 将蛇葡萄根、白蔹
19、等 4 味中药的 70% 乙醇提取物制成外用蛇葡萄根霜剂，体外抑菌实验表明，此霜剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌 有不同程度的抑制作用。 口腔微生物通过腐败消化口腔内的滞留物质产生挥发性硫化物（ VSCs）及其它异味物质导致口臭。朱彩莲等 15通过测定挥发性硫化物，发现白蔹对临床采集的牙周病口臭患者 唾液细菌的抑菌率为 45%。 2 实验内容 2.1 实验流程 5 本课题采用将不同浓度白蔹的乙酸乙酯提取物加入到装有菌悬液的 96孔板中隔夜培养 1618小时，然后加入 MTT 指示剂，培养 4 个小时后，用 DMSO 溶解沉淀物，在 490nm 波长下，用酶标仪测定其吸光度。实验流程如
20、下： 菌种 菌种活化 菌悬液和培养基制备 加入白蔹乙酸乙酯提取物并隔夜培养 以 MTT 为指示剂进行快速筛选 490nm 吸光度测定 结果与分析 图 2.1 抗菌实验流程示意图 2.2 分析方法 6 MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（ Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（ DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定 细胞数范围内， MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。相比于常规方法耗时更短，操作简便
21、，可以得到比较精确的结果。因此我们可以根据吸光度与提取物浓度的关系定量的测得抗菌活性。 2.3 实验内容 2.3.1 实验器材： 试剂及菌种： DMSO（ 二甲基亚砜 ） MTT 牛肉膏 蛋白胨 琼脂 蒸馏水 氯化钠 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 白蔹 乙醇 乙酸乙酯 。 表 2.1 实验器材汇总 型号 名称 出厂商 FA1004型 电子分析天平 上海良平仪器仪表有限公司 FZ102型 微型植物粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司 318C型 酶标仪 上海沛欧仪器有限公司 YXQ-LS-SH型 全自动立式电热压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司 SC.101-1型 鼓风电热恒温干燥箱 上海嘉鹏科技有限公司 RE-52 AAA型 旋转蒸发仪 嘉兴市新城东成仪器厂 Cl-100型 双层铁皮电炉 浙江嘉兴凤桥电热器厂 VS-1300型 洁净工作台 苏州市苏信净化设备厂 THZ-82型 电热恒温培养箱 金坛市万华实验仪器厂 托盘天平，烧杯接种针，镊子，玻璃棒，标签纸，棉花，酒精灯，石棉网，抽滤机、移液枪、试管。
