1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 耐高浓度酒精的酵母筛选及发酵工艺研究 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘 要 : 随着地球上化石能源 (石油、煤炭、天燃气等 )的日趋枯竭和全球环境保护意识的不断加强，用生物乙醇 (也 称燃料乙醇 )取代部分石化燃料已经成为国家能源战略的重要组成部分。本论文系统地研究了黄酒酵母的乙醇发酵特性，同时也对黄酒酵母进行科学合理诱变，主要采用了物理诱变的方法，如紫外诱变、微波诱变和超声波诱变，使其耐酒精能力增加。通过筛选微波诱变后的耐高酒精度的酵母，并且获得其最佳培养条件： 15%的蔗糖、 2.0%的蛋白
2、胨、 2.5%的酵母膏、 20%的葡萄糖、 0.5%的氯化钠、 0.5%的磷酸二氢钾、 0.15%的 七水硫酸镁、 0.04%的磷酸二氢钾、 0.075%的硫酸铵、 0.3%的氯化钙。突变菌株的酒精耐受能力得到了明显提高 ，该突变菌株易于培养，有一定发展和应用的前景。 关键词 : 诱变；筛选；突变株；培养条件优化 II Study on the isolation of high alcohol tolerance stain of yeast and its fermentation Abstract: Due to the imminent decline in the availabil
3、ity of global fossil energy (oil, coal and natural gas) and increasing concern over the issue of environment protection, partically substitution of fossil fuel with bioethanol has become an important renewable energy strategy.This paper systematically studied the characteristic of rice wine yeast, a
4、lso mutant was studied scientificly, with the physical mutation methods such as UV, microwave and ultrasonic methods. Mutation, was able to increase resistance to alcohol. The mutant was cultured in optimed conditions: 15% sucrose, 2.0% peptone, 2.5% yeast extract, 20% glucose, 0.5% sodium chloride,
5、 0.5% potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate heptahydrate 0.15%, 0.04% dihydrogen phosphate Potassium, 0.075% ammonium sulfate, 0.3%calcium chloride. Mutant with higher risistance to alcohol was aquired and easily cultured. There are some prospects for the development and application. Key
6、words: Mutagenesis; Isolation; Mutation strains; Optimum culture conditions 目 录 摘要 Abstract 1 绪论 （ 1） 1.1 选题的背景和意义 （ 1） 1.2 相关研究的最新成果及动态 （ 1） 2 实验部分 （ 6） 2.1 实验材料 （ 6） 2.2 主要药品与试剂 （ 6） 2.3 主要仪器和设备 （ 6） 2.4 培养基 （ 7） 2.5 实验方法 （ 7） 3 结果与分析 （ 10） 3.1 出发酵母菌株的测定 （ 10） 3.2 黄酒酵母耐酒精度的测定 （ 10） 3.3 菌株的诱变 （ 11）
7、 3.4 筛选诱变株 （ 12） 3.5 单因素测定 （ 12） 4 结论 （ 18） 参考文献 （ 19） 致谢 （ 21） 1 1 绪论 1.1 选题的背景和意义 石油作为国民经济发展的战略物资在经过人类近二百年的开采后，面临全球桔竭的局面。特别是近年来，随着经济的持续增长和石油需求迅速膨胀，我国已成为继美国之后的第二大能源消费国。针对我国人多地少、粮食紧缺和石油短缺的国情，依据不与人争粮、不与粮争地，能源原料多元化，实现持续发展的原则，开发非粮燃料乙醇生物能源，降低生产成本，提高转化效率 ，确保现代社会发展的需求，已成为国家新能源战略发展最紧迫的任务。传统酿酒酵母的酒精发酵最适温度不高，
8、一般为 25 一 30 ；耐酒性较差，耐酒精浓度在 10左右。一方面，在杂菌污染严重的情况下，生产上不仅要求无菌条件严格，操作难度较大，而且为了控制因发酵热所引起的温度上升，需要加入大量冷却水 (甚至在部分气温较高地区，因发酵过程中过热，根本无法进行正常生产 )，导致乙醇生产成本增加 1-2；另一方面，酵母的耐酒精度较低，产物的抑制作用降低乙醇酵母的产乙醇潜力。因此，耐受性酒精高温酵母的选育研究已成为国内外酒精行业 的研究热点3-4。 乙醇酵母对生活条件的变化有迅速的适应能力，并且随着外界环境的变化，其群体能迅速产生变种，这为耐酒精酵母的筛选提供了可能 1。耐高温酵母不是微生物分类学上的名词，
9、而是从生态方面表达此类酵母对温度的忍耐性与普通酵母的差异。筛选耐高温的乙醇酵母菌株，其生产上的优势主要体现在： 具有较高的发酵能力，即能快速并完全将糖分转化成乙醇，能够解决糖化温度和发酵温度不协调的矛盾，实现真正意义上的边糖化边发酵，从而减少葡萄糖对纤维素酶的抑制作用，提高纤维素酶的糖化率，进而提高纤维素发酵生产燃料乙醇的得 率 2-3； 繁殖速度快，即具有高的比生长速度，高温发酵还能够提高发酵效率，降低发酵时的冷却成本 4； 具有高的耐酒精能力，即对本身代谢产物的稳定性高。因而可以进行浓醪发酵； 抗杂菌能力强，即对杂菌代谢产物的稳定性高。耐有机酸能力强； 对培养基的适应性强。耐温、耐盐和耐干
10、物质浓度的性能强。 1.2 相关研究的最新成果及动态 1.2.1 传统的酵母菌育种技术 （ 1）自然界筛选和高温驯化 长期以来，高温菌株的选育主要集中在利用自然界筛选和高温驯化。驯化就是通过破坏微生物正常的生活条件，积累定向变异而实现 的。相比较于诱变育种和利用细胞原生质体融合，进而发生细胞核染色体基因间的重组获得新种。驯化具有培育条件温和、操作简单、投入少、易掌握2 等优点。通过对菌株的驯化、筛选。获得优良菌株，不失为是一种改良菌种的好方法 5。 （ 2）杂交育种 杂交育种是依靠酵母的生活史 ,利用其具有不同遗传特性和相反交配型的细胞能产生新的双倍体的特性，通过杂交获取满足生产需要的某些特有
11、性能，从而获得优良菌株的育种方法。杂交后的新菌株应具有稳定的遗传特性，否则就没有实用价值。利用杂交育种，选育耐乙醇酵母，可以利用不同特性的乙醇酵母菌株进行 生孢培养、孢子分离试验等，得到酵母菌单倍体，然后利用酒精发酵试验进行复筛，得到性能最优良的单倍体，作为杂交试验的亲本。杂交试验后 ,经过性能测定 ,得到理想的乙醇酵母菌株 6。 （ 3）诱变育种技术 诱变育种是指利用物理或化学诱变剂处理微生物细胞。显著提高变异的频率，使人们可以简便、快速地筛选出各种类型的突变菌株作生产和研究之用 7。微生物的自发突变几率是很低的一般在 10-6 10-9间，变异程度轻微，育种成功率相对较低；而通过诱变剂的作
12、用进行的诱变育种则可以大大提高育种的成功率。物理诱变剂包括紫外线、 X-射线、 -射线、 -射线、快中子、激光、离子束等，其中常用于酵母菌的诱变选育的是紫外线。 紫外诱变效应主要是指紫外线照射引起菌株 DNA结构的改变，阻碍 DNA的复制或引起碱基排列次序的变化，从而引起基因突变 8。使用方便、不需要专人操作、经济、危险性小、适用范围广泛等优点，使得紫外线成为工业微生物诱变育种的首选诱变剂，并且已经在多种工业微生物中均被证明诱变效果良好 9。由于在一般的微生物中都存在着光复活作用所以在进行紫外线处理时，只能在红光下或黑暗中进行照射及处理照射后的菌液，以免发生光复活作用。申玉 香等 10将APV
13、菌株经紫外线诱变后筛出苯黄隆抗性菌株 2#菌株，发酵双乙酰峰值为 0.36 mg L，真正发酵度为 65.8。 Walid A Lotfy等 11用紫外线柠檬酸产生菌 Aspergillus niger UMIP2564获得成品收率达到 60.25的变异菌株 W5。石一珺等 12采用紫外线 2次复合诱变处理内生真菌哈茨木霉，获得了突变株 UV-5-3，大大提高了原始菌株发酵液的活性，其抗生素含量远远超出出发菌株。 化学诱变技术是指利用一些化学物质提高生物的自然突变率，这些化学物质就叫做 “化学诱变剂 ”。化学诱变育种是人为地利用化学诱变剂 ,诱发作物发生突变 ,再通过多世代对突变体进行选择和鉴
14、定，直接或间接地培育成生产上能利用的作物新品种。其特点：可操作性强，简单易行；特异性较强，能诱变定位到 DNA上的某些碱基；后代较易稳定遗传，一般到 F3代就可稳定；应用于遗传标记，是细胞融合技术的基础 13。化学诱变剂种类很多，包括亚硝酸、乙基磺酸甲烷 (EMS)、硫酸二乙酯 (DES)、 N-甲基 -N-硝基、 N-亚硝基胍 (MNNG)、亚硝基乙基脲 (NEW)、碱基类似物等 ,3 其中 EMS较为有效，称为超诱变剂。王璋等 14使 用亚硝基胍处理萌发状态的链霉菌 WZFF孢子悬浮液，结果得到 l株转谷氨酰胺酶活比出发菌株提高 1.2倍的突变菌株 WZFF.W-12.varMN一 35。
15、 1.2.2 新兴的酵母菌育种技术 （ 1）新兴的诱变源 低能重离子束 离子注入诱变技术是近些年发展起来的物理诱变技术。是一种新兴的诱变方法和途径。离子在注入过程中不断与生物分子键合，置换或填充空位形成新的分子基团，可引起 DNA键断裂，导致大量受体原子移位、重组，形成新的分子结构和基团。从而能够使酵母菌产生丰富的基因突变，从而获得高突变率。离子注入既存在着电荷交换、能量交换、 动量交换等过程，和稳定性能试验等证明为稳定的融合子，并在 45 下又存在着入射离子沉积过程，动量、能量、电荷、质量 4种作用均可引发不同的生物学效应 13。 离子注入技术与其他的诱变源相比，作为一种新的辐射源，在生命科
16、学研究中占有重要的独特地位，因为它具有常规辐射源所没有的优势： 传能线密度大： 相对生物效率高； 损伤后修复效应小； 能量沉积的空间分辨性好； 氧效应小； 细胞在不同时相内对重离子束敏感性的差异不大等 15。 卫军等采用 N离子束对谷氨酸棒杆菌进行诱变处理，筛选磺胺胍抗性突变菌株，选育出 1株 L一 精氨酸产量较高和产酸性能比较稳定的突变菌株，比出发菌株提高了 24.8。蒋世春等将抗肿瘤抗生素柔红霉素产生菌 天兰淡红链霉菌激光株经 N等离子体诱变处理后再经摇瓶筛选，获得 1株高产柔红霉素突变株，其柔红霉素效价较亲株提高了 25.8 16。 （ 2）原生质体融合技术 原生质体融合作为一种更为广泛
17、随机的基因重组方式，能够克服细胞壁这一层天然屏障，排除接合型的限制。实现多基因重组：还可直接采用生产性状好的菌株作为亲本，加速工业酵母菌种改良进程，为优良工业酵母的选育提供了一个崭新的途径。原生质体融合通常是以 2亲株 的细胞膜的融合为起点，经细胞质的完全融合，直至基因组的交换重组，产生众多的重组子，从中筛选出理想的重组子。原生质体融合也可以和其他育种方法相结合，将多种优良性状组合到一个单株中，大大缩短育种周期 17。 高玉荣等 18筛选出初始富硒能力相对较高的酵母菌株 As2.16l作为出发菌株。用溶壁酶对AS2.161菌进行酶解破壁，酶的最适添加量为 1 g/100 mL，最适酶解时间为
18、120 min，菌体原生质体的形成率为 95.2，再生率为 21.8。用紫外线进行原质体诱变育种，并进行初筛和复筛，最终获得一株菌体富 硒量为 821 mg/kg，菌体收获量为 0.88 g/100 mL。 4 文铁桥等利用酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)A001和克鲁维酵母 (Kluyveromyces sp.)Y034属间原生质体融合构建高温酵母菌株，对制备高再生活性原生质体及融合子细胞形态、生理化特征、同工酶性质、遗传稳定性和高温发酵等方面进行了研究。结果表明，融合子 AY023和 AY680遗传性能稳定。表达了双亲优良性状，获得了在 45 培养条件下产酒率
19、 7.4的属间融合菌株 19。蒋岳等利用原生质体电诱导融合构建了 l株耐高温菌株，可在 38 条件下浓醪发酵，酒精度为12.3；在 40 条件下浓醪发酵，酒精度为 10.7的融合株 20。 （ 3）基因工程技术 基因工程，也称为 DNA重组技术 21。利用基因工程技术改造酵母菌种，是指将外源基因转入乙醇酵母，给予菌种新的发酵性能，达到增强菌种发酵性能和应用价值的目的。基因工程的一般步骤是对已经清楚的基因进行克隆诱变，再通过基因操作将其整合入受体菌株，并保持重组菌株的遗传稳定性。 Yomashita等人 22成功地将嗜杀酵母的基因转到啤酒酵母中，嗜杀啤酒酵母能抑制发酵过程中野生酵母的生长，净化发
20、酵系统。 T. Fuji23等从 S. cerevisiae和 S. uvarum品系中克隆编码此酶的基因，转导到酵母细胞中，结果乙醇乙酰转移酶表现出高活性，强化了啤酒的香味。 （ 4）超高压 超高压导致细胞体积减小，胞内物质浓缩，使得先前互不接触的各种酶、蛋白质及核酸类物质接触，这种接触必然会导致一些不可预测的反应发生，如 DNA在高压下会与切割 DNA的核酸内切酶接触而使得 DNA发生变化。研究发现， DNA在高压长时间处理下， DNA合成对压力敏感。高压可以影响到 DNA的超螺旋结构，甚至影响 DNA母链的解旋，还使得 DNA失去紧急修复的应急反应 (SOS)机制。在传统的诱变剂反复使用
21、、诱变产量提高到极限易发生退化的情况下，超高压可望作为 1种新型的物理诱变育种手段，而且具有操作简便、无污染等优点。 高翔等 24用 220 MPa高压处理大肠杆菌 TG1、 DH5a和 HBIOI，得到了耐压的突变株 TGIP、 DH5 cxP 和 HBIO1P。 （ 5）空间诱变 自空间探索以来，人们一直致力于研究空间特殊环境中，诸如微重力、高能粒子辐射等诱变因素对微生物的复合影响，其中微重力和空间辐射是主要的诱变因素。在空间特殊条 件中，微生物的变异频率较高。 DNA和生物膜是射线作用的靶子， DNA结构的损伤主要有单、双链断裂，碱基和糖的损伤， DNA与 DNA、 DNA与蛋白质交联等
22、。其中单、双链断裂较多见，富含胸腺嘧啶的区域最易受到破坏，膜损伤有膜结构的改变、膜结合酶活性和膜受体功能降低等。白骅等通过空5 间诱变选育毒三素链霉菌，正变率达到 39，产量提高 19.2。王璋等 25利用 “神舟 ”4号无人飞船搭载生产微生物转谷氨酰胺酶的链霉菌进行空间诱变，得到 1株高产酶菌株，酶活性提高了 40 以上，达到 3.62 U/mL。 6 2 实验部分 2.1 实验材料 2.3.1 菌株 实验菌株：主要菌种如表 2-1。 表 2-1 实验主要菌种 菌种 规格 来源 生香酵母 黄酒酵母 耐高温酵母 市售 市售 市售 安琪酵母公司 安琪酵母公司 安琪酵母公司 2.2 主要药品与试剂 主要化学药品和试剂如表 2-2所列。 表 2-2 主要化学药品和试剂 名 称 规 格 来 源 蛋白胨 生化试剂 浙江海川化学品有限公司 MgSO47H2O 分析纯 金山区兴塔美兴化工厂 CaCl2 分析纯 宜兴市亚盛化工厂 KH2PO4 分析纯 上海化学试 剂总厂 葡萄糖 分析纯 广东光华化学厂有限公司 蔗糖 麦芽糖 酵母膏 NaCl NH4NO3 分析纯 市售 分析纯 分析纯 分析纯 温州市化学用料厂 国药集团化学试剂有限公司 广东光华化学厂有限公司 广东化学试剂厂 2.3 主要仪器和设备 主要仪器和设备如表 2-3 所列。
