1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 萱草愈伤组织芽分化培养基的筛选 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘 要 在本 实验中以萱草花梗茎段为试验试材 ,以 MS 为基本培养基 ,分别添加不同浓度的 BA和 NAA 来确定最佳的诱导愈 伤组织培养基和丛生芽增殖的培养基。试验结果表明 :MS + BA 0.5mg/L + NAA 0.1mg/L 的固体培养基 ,有很好的诱导外植体产生愈伤组织的效果。 关键词 ： 萱草； 愈伤组织；芽分化 II Screening culture medium of callus inducement and
2、 shoot differentiation of Hemerocallis in Vitro ABSTRACT The experiments were used the stem of Hemerocallis fulva as test plant. The MS as culture medium were each added different concentration BA and NAA. The results of experiments: MS solid culture medium added BA 0.5mg/L and NAA 0.1mg/L had good
3、induced effect to explantation growth callus and the next-generation culture. Keyword: Hemerocallis ； callus ； bud initiation 目 录 摘要 ABSTRACT 1 绪论 . 1 1.1 概述 1 1.2 萱草的传统繁殖方法 . 2 1.3 萱草的现代繁殖方法 2 1.3.1 植物组织培养和芽分化 .2 1.3.2 萱草的组织培养 4 2 材料与方法 5 2.1 材料 5 2.1.1 试验材料 . 5 2.1.2 实验药品 . 5 2.1.3 实验仪器 . 6 2.2 方法
4、 6 2.2.1 培养基的制备 . 6 2.2.2 萱草外植体处理 . 6 2.2.3 接种及培养 . 7 2.2.4 培养条件 . 8 3 结果与分析 . 8 3.1 不同灭菌剂及灭菌时间对外植体污染率与成活率的影响 10 3.2 不同激素组合对初代培养的影响 . . . 11 3.3 不同生长调节剂组合对丛生芽增殖培养的影响 . . 13 4 讨论 14 4.1 萱草植物组织培养中的灭菌操作 14 4.2 萱草植物组织培养中对植物激素的选择 15 4.3 萱草植物组织培养的培养基配方及培养条件的选择 15 致谢 16 参考文献 17 1 1 绪论 1.1 概述 萱草系百合科多年生草本植物。
5、以根及根茎入药 ,为我国传统中药“萱草根” ,具有清热凉血、利尿通淋的功效 ,用于治疗水肿、小便不利、淋浊、带下、黄疸、便血、崩漏等症 【 1-2】 。萱草不仅具有药用价值 ,还具有花卉观赏和蔬菜食用价值。萱草叶狭长 ,花呈喇叭形 , 花茎变化大 , 花形各异 , 花期从晚春一直到秋季 , 盛花期可延续几个月 ,被广泛用于绿化工程。它不仅供人观赏 , 也可将花蕾作蔬菜供人食用 , 其花经过加工后是颇负盛名的“黄花菜”、“金针菜” ,营养丰富 ,且具有保健益寿之功 。新研究表明萱草根中含有多种蒽醌类和二氢呋喃 - - 内酰铵类化合物 ,这些成分具有抗菌、抗癌、杀虫等生物活性 【 3】 。 萱草原
6、产于亚、欧各国 ， 萱草属植物自欧洲南部经亚洲北部直至日本均有分布 ， 属广布种 ， 但主要分布于东亚 ， 其分布区北缘大约在北纬 50 60 ， 分布区南缘在我国福建、广东、广西、云南及西藏东部地区。 1753 年瑞典植物学家林奈建立萱草属 7 ， 萱草属全世界约有 146 ， 1893 年 ， 英国人 GeorgeOyeld 登记注册了第一个萱草栽培品种“ Aprioot” ， 至今 ， 园艺品种已多达万种以上 7 。我国具有丰富的萱草属植物资源 ， 原产我国的有 11 个种 ，从种的总数及特有种数目看 ， 我国是萱草属现代分布多度中心和分化中心。我国关于萱草属植物的记载最早见于诗经 ，
7、距今约两千多年历史 ,其栽培在我国起始于汉代 ， 至明代中叶 ， 被作为菜广泛栽培 ， 主要集中在我国长江流域 ， 目前南北各省均有种植 。中国萱草在中世纪时开始传到欧洲 ， 西北地区有 6 种 ， 集中在东北的有 6 种 8 ， 其中折叶萱草 ( H. plica2ta) 、西南萱草 ( H. f orrestii) 、矮萱草 ( H. nana) 和多花萱草 ( H. multi f lora) 为中国特有种 9 。至 1890 年除个别种外 ， 几乎所有的萱草种都被引到欧美 ， 随后 ， 多个国家特别是美国广泛开展了对萱草属植物种的分类、解剖生理、生态适应性、园林用途等方面的研究10,1
8、1 。 近百年来萱草属植物的分类问题一直存在争议 ， 在长期栽培过程中 ， 其园艺杂交品种多 ，另有一些天然杂交种 ， 出现种间外部形态高度相似、栽培种与野生种并存等因素 ， 给分类带来困难 ， 尤其在对标本鉴定时难度大 。 很可能发生标本误定 ， 关于品种分类的数据难于统一比较。不同研究者有不同分类处理中国植物志记载全属有 14 种 ， 我国国产 11 种 ； Hu S Y整理了本属 23种及若干变种 ， 并以开花起始时间的变化范围为区分萱草属部分植物的依据 ， 松冈通夫和掘田满 1966 年认为有 6 种 ； 大井次三郎 1969 年记载日本产 9 种 ， 朝鲜植物图鉴收录朝鲜产 4 种
9、， 而大韩植物图鉴记载有 7 种。此外 ， 在属内是否分组及分组数量等问题方面不同学者也有不同意见 ， Nakai 认为日本萱草属植物分 6 组 ， 并将中国萱草属夜间开花植物分两组 ， Matsuoka 等将我国产夜间开花萱草处理为 1 个组 ， 亦有其他学者将其区分为若干独立物种。 Noguchi根据萱草分布的地理区域和形态学特征进行分类。熊治2 廷等根据核型、外部形态及地理分布资料的综合分析 ， 将北萱草与大苞萱草 ( H. mi ddendorf ii Trautv . etMey. )区分为不同物种 ， 而不是同一物种的不同变种 ； 孔红等的研究表明 ， 萱草属植物花粉形态和种子表面
10、微形态在种的分类上具有一定意义 ， 且种子表面微形态与核型、花粉形态、过氧化物同工酶之间具有一定相关性。于晓英等采用 SDS 和 CTAB 法从萱草幼叶、成熟叶、新根等部位中提取 DNA ， 获得 AFLP 图谱 ， 为萱草属植物资源研究提供依据 ,其中幼 叶的 DNA 产量和品质最好 ， CTAB 法提取的 DNA 纯度较高且程序简单。 1.2 萱草的传统繁殖方法 萱草属植物可采用播种、扦插、分株和组织培养等方法繁殖，常用方法为分株和组织培养繁殖。萱草分生能力强 ,可从根茎部发生多数萌蘖，分株繁殖是萱草属植物常用而经济的繁殖方法。分株繁殖多在春季萌芽前或秋季落叶后进行。分株繁殖在最短时间内获
11、得有开花能力的植株，并能保持品种特性 ,但繁殖系数低 ,不适于大规模商业生产。有关萱草属植物组织培养的研究主要集中在食用黄花菜和多倍体萱草 12-14 。自然界的 1 株萱草一般靠 分蘖繁殖每年仅能繁殖 4 5 株。 扦插繁殖具有成本低廉、操作简便等优点而被广泛推广。萱草有些品种在花茎抽出后 ,自花茎中下部的节位上发生茎生芽 ,茎生芽可在花茎干枯前剥下扦插成苗 15。但它也存在着以下不足：采用茎段扦插的方法需耗费大量的母本材料，周期长，繁殖效率较低。用叶片进行扦插会出现部分扦插苗地上部生长缓慢的情况。扦插不当会对切口细胞产生不利的影响 ,造成插穗的腐烂。季节的不同导致的环境变化 ,对插材的生根
12、成活率影响较大。扦插容易感染病毒病。 分株繁殖较为常用，且植株容易存活。栽植地最好是地下水位低 的平地或水源、灌溉条件好的坡地 ,排水良好、土质疏松、土层深厚 16。分株繁殖 17一般在 3 月中旬和 10 月中下旬进行。首先挖出株丛 ,再用刀将株丛分切成 1 至 2 个芽的小株 ,每小株需带一定的根 ,切忌切伤生长点。春天分株 ,夏季即可开花 ,只是花期略有推迟。秋季分株宜早不宜晚 ,上冻前浇好越冬水 ,以确保安全越冬。栽种时应选择晴天进行，边挖苗、边分株、边栽苗，尽量少伤根，有利于缓苗。一般情况下 2 至 3 年分株 1 次 ,以保证有旺盛的生长势。可见，萱草分株繁殖能力不强、增殖速度慢，
13、因而难以适应市场商品化生产的需求 。 因此，寻求一种新 的稳定而高效的繁殖方法，对萱草具有重要意义。 1.3 萱草的现代繁殖方法 1.3.1 植物组织培养和芽分化 植物组织培养是以植物生理学为基础发展起来的一门新生的生物技术学科。植物组织培3 养包括了所有类型的无菌培养技术， 主要有： 成熟及未成熟植物胚胎的离体培养； 离体器官包括根尖、 茎尖、 叶原基、 花器官原基或未成熟花器官各部分以及未成熟果实的培养；从植物各种器官的外殖体增殖而形成的愈伤组织培养； 能保持良好分散性的离体细胞或很小细胞团的液体培养； 除去细胞壁的植物原生质体培养。这一学科的建立和发展， 对植物科学的各个领域如细胞学、
14、胚胎学、 遗传学、 生理学、 生物化学、 植物病理学、 发育生物学等学科的发展均有很大的促进作用。广泛应用于植物的快速繁殖、植物品种改良、 基因工程育种、 种质资源保存、 次生代谢产物生产等方面， 对现代农业和医药等领域产生了深刻影响。 【 18】 在芽分化期 ， 采用酶联免疫吸附法 (ELISA)测定芽内 4 种内源激素吲哚乙酸 (IAA)、赤霉素 (GA)、玉米素核苷 (ZRs)和脱落酸 (ABA)含量的动态变化 。 结果表明 ： 在芽生理分化期 ，GA 和 IAA 含量有所增加 ， 但在芽形态分化开始以后 GA 的含 量呈逐步下降趋势 ， 直至分化结束 ； ZRs 含量在芽生理分化期呈上
15、升趋势 ， 在形态分化前期含量出现高峰 ， 进入形态分化期后其含量下降 ； ABA 含量在芽分化初期有逐步增加的趋势 ， 在达到最高水平 后， 至芽形态分化结束 ， ABA 的含量呈逐步下降趋势 ， 但其变化相对平稳 。 研究认为芽分化期需要有高水平的 ZRs、低水平的 GA 和 IAA。 （一） 植物脱毒技术 植物脱毒技术往往与植物组培快繁技术结合在一起应用。植物在发育过程中不可避免地会感染病毒， 解决此问题的一个重要途径就是脱毒培养。在植物体内， 病毒主要通过维管束组织进行运输和扩散， 茎尖新生的分生组织， 没有维管束分化， 病毒难以到达， 因此病毒含量很低， 甚至没有。所以采取茎尖培养可
16、减少再生植株的病毒含量， 连续进行几代培养， 甚至可获得无病毒植株， 使植物得以复壮。脱毒植株增加产量、 提高品质的效应非常明显， 有广阔的应用前景。然而， 植物脱毒培养也存在一些技术上的问题。通常， 取茎尖 【 19】 的分生组织进行脱毒培养， 尽管有高倍显微镜帮助， 操作也很不易； 其次， 把这样小的材料培养成再生植株也不是一件容易的事。此外， 有些病毒能够侵入顶端分生组织， 对此材料需要用高温处理等方法 来杀死病毒， 更增加了组织脱毒培养的难度。在脱毒培养过程中， 病毒检测是一道不可缺少的程序， 常用的方法有敏感植物法、 抗血清法。每种方法都有其局限性， 如敏感植物法需时间较长。随着植物
17、组培脱毒产业化的兴起， 需要大量的病毒检测， 所以开发出应用简便， 用时少， 价格低，适用于多种病毒检测的技术， 具有重要意义。 【 20】 （二） 灭菌 灭菌 21就是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有有生命的物质全部杀死。植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，这是因为培养基含有丰 富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使组培苗能正常4 生长。外植体的灭菌通常采用化学药剂浸泡的方法。灭菌时间过长，会伤害侧芽，而时间过短，会因灭菌不彻底而引起污染。对一些容易
18、污染、较难灭菌的外植体进行灭菌时，用单一灭菌剂不能收到好的效果。所以有时候选用两种灭菌剂交替浸泡法，这样就可以保证常规的细菌被杀除。 （三） 外植体的选择 植物细胞具有全能性，通常认为选择植物合适的器官组织做为外植体，只要在合适的条件下 培养，最终会经过脱分化再分化成完整植株。 不同外植体的诱导分化能力不同 ,其中脚芽的诱导分化能力最好，花蕾次之，花茎的诱导分化能力次于花蕾，而花瓣的诱导分化能力最差。所以在选择组织培养用的外植体时，要选择花茎幼嫩的最上部。 四 植物组织培养的应用 1 大规模快速无性繁殖的植物组织细胞培养 的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，对植物生
19、长极为有利，生长周期短，便于稳定地进行周年生产，而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖。由于上述特点，加上组培苗的小型化，可使有限的空间培养出大量的植物 。 在选材消毒、接种培养、诱导筛选、继代保存、分离鉴定等方面建立了一整套完整的技术方法，运用组织培养的方法可大大提高繁殖效率。 【 22】 2.药用植物由于受到不良因素的影响，易退化和变种，影响品质和产量。可利用组织培养选用优良品种的药用植物储备足够的活种质，以便应用它们来开发研制。 3 培养无病的药用植物品种，促进良种栽培许多植物在自然生长环境往往患有病毒，且代代相传，严重影响中药材的产量和质量。采用微茎尖培养方法可得到无病毒苗后，微茎尖培养
20、就成为解决病毒病危害的重要途径之一。若与热处理相结合，则可提高脱毒培养的 效果。组织培养无病毒苗的方法已在很多作物的常规生产中得到应用。而且已有不少地区建立了无病毒苗的生产中心，这对于无病毒苗的培养、鉴定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一个规范的系统程序，从而达到了保持园艺植物的优良种性和经济性状的目的。 4.生产药物活性成分随着中药在临床的广泛使用，特别是珍贵药用植物资源匮乏、生长缓慢、产量低，难以满足临床的需要，利用药用植物组织培养技术生产药用活性成分来代替原植物。目前，进行植物组织细胞培养研究的植物已达百余种，其中以生产次生代谢产物研究的细胞工程近 100 多种，从组织细胞培养 物中产生
21、的天然药物活性成分有 600 种左右，包括生物碱、醌类、甾醇、皂苷、酶类等。 【 23】 1.3.2 萱草的组织培养 萱草属植物组织培养中花器官的出愈率较叶片高 ， 但其取材却仅限于花季 ， 有较大的局限性 ， 以茎尖为外植体进行大花萱草的组织培养 ， 其出愈率较高 ， 能快速繁殖 ， 取材不受季节限制 ， 这为快速繁殖良种或育种材料提供了一条可行的新途径。利用大花萱草茎尖为外5 植体在诱导培养中培养 ， 诱导产生愈伤组织 ， 筛选出培养基。 【 24】 王晓娟等将清洗干净的萱草茎尖用自来水冲洗过夜 ， 在无菌条 件下 ， 用 75 %酒精消毒15 s ， 再转入 0. 1 %升汞溶液浸泡 8
22、 min， 最后用无菌水冲洗 4 5 次。用消毒的解剖刀将最外层的叶片剥去后 ， 从中间将茎尖纵向一切为二 ， 切成 1 cm左右的长度 ， 接种到愈伤组织诱导培养基上培养。外植体接种到愈伤组织培养基上 20 d 后 ， 茎尖基部开始萌动 ,产生淡黄色愈伤组织。 30 d 后 ， 将老死褐化部分切除 ， 新生愈伤组织连同外植体转入新鲜培养基上继续培养。将产生的愈伤组织块每隔 30 d 转移一次 ， 至有大量的愈伤组织块产生。将淡黄色的愈伤组织块切成小块转入继代培养基中。 10 d 后 ， 淡黄色的愈伤组织逐渐变绿 ， 开始产生许多新生芽点 ， 每个新生芽点均可成长为一棵无根再生苗 。 丛生芽的
23、增殖系数达 4. 5 左右 ，芽体健壮 ,生长迅速。 在此培养过程中，每隔 20 30 d 要转接一次新鲜培养基，以保证愈伤组织和新生芽对营养的需求。 【 25】 2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 试验材料 试验材料为吉星萱草植株 (图 2-1)。 图 2-1 试验用萱草植株 2.1.2 实验药品 HgCl2、 NH4NO3、 KNO3、 MgSO4 7H2O、 KH2PO4、 CaCl2 2H2O、 KI、 H3BO3、 MnSO4 4H2O、ZnSO4 7H2O、 Na2 MoO4 2H2O、 CuSO4 5H2O、 CoCl2 6H2O、 FeSO4 7H2O、 Na2 EDTA
24、 2H2O、琼脂、蒸馏水、乙醇、氢氧化钾、盐酸、蔗糖、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸 6 2.1.3 实验仪器 超净工作台、滤纸、培养皿、玻璃棒、 pH 计、烧杯、电磁炉、不锈钢锅、玻璃容器、镊子、刀片、容量瓶等 2.2 方法 2.2.1 培养基的制备 （ 1） MS 基本培养基的配方 母液： NH4NO3(33g/L)、 KNO3(38g/L)、 MgSO4 7H2O(7.4g/L)、 KH2PO4(3.4g/L) 母液 (Ca2+)： CaCl2 2H2O(8.8g/L) 母液： KI（ 0.166g/L） 、 H3BO3（ 1.24g/L） 、 MnSO4 4H2O（ 4.4
25、6g/L） 、 ZnSO4 7H2O（ 1.72g/L） 、Na2 MoO4 2H2O（ 0.05g/L） 、 CuSO4 5H2O（ 0.005g/L） 、 CoCl2 6H2O（ 0.005g/L） 母液： FeSO4 7H2O(5.56g/L)、 Na2 EDTA 2H2O(7.46g/L) 母液：肌醇 (20g/L)、 烟酸 (0.1g/L)、盐酸吡哆醇 (0.1g/L)、盐酸硫胺素 (0.1g/L)、甘氨酸 (0.4g/L) （ 2） 制备培养基的步骤 在 1000ml 的大烧杯中加入蒸馏水约 600ml，用移液枪分别加入母液 100ml，母液（ Ca2+） 50ml，母液 10ml
26、，母液 10ml，肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸各 2ml； 再在烧杯中加入适宜浓度所选择的植物激素 BA 和 NAA； 加入适量蒸馏水使定容到 1000ml,将烧杯置于 pH 计上，放入磁珠，打开开关，使溶液搅拌均匀； 充分混合之后，用 1mol/L NaOH 和 1mol/L HCl 调节培养基的 pH 值到 5.8； 将混合溶液倒入不锈钢锅中，并加入称出的 4.5g 琼脂和 30g 蔗糖，加热，同时用玻璃棒不断搅拌，直至溶液沸腾到颜色澄清； 趁热把溶液倒回大烧杯中，加入蒸馏水再次定容到 1000ml（弥补沸腾蒸发所失去的水分），紧接着将培养基分装到所选用的玻璃容器中，每个大概 75ml； 拧好特质的塑料盖后，置于高压灭菌锅 0.11MPa 121灭菌 20 分钟； 灭好菌后，将玻璃容器放置于接种用的无菌室中，使之冷却，凝固，备用。 2.2.2 萱草外植体 处理 萱草外植体选用幼嫩花梗，在接种前需将外植体进行灭菌处理，处理步骤如下： 从健壮、无病虫害的吉星萱草植株上选取幼嫩花梗，将之浸泡在装有洗衣粉溶液的大烧杯中 30min； 之后置于自来水龙头下，流水冲洗 3 至 4 小时，为防止花梗由于浮力而划出烧杯，
