1、 1 毕业论文 开题报告 生物工程 天然色素生产菌的鉴定 1 选题的背景和意义 色素分为人工合成色素和天然色素两大类 ,在实际生活中应用广泛。由于合成色素的安全性问题 ,不少合成色素在各国允许使用的程度被大大限制 ,尤其是在食品、医药和化妆品行业。而天然色素与人工合成色素相比有无毒、安全性高、色泽自然鲜艳、并有很高的营养价值和药理功能等优越性 ,日益受到人们的重视和青睐 ,天然色素的提取和应用已成为现今和未来发展的主要方向 1 。目前天然色素主要是从植物、动物和微生物细胞中获取 ,由于动植物材料生长繁殖受季节、气候、产地等因 素的影响 ,原料不足 ,从中提取的色素价格昂贵 ,其应用受到很大的限
2、制 ;而利用微生物资源生产天然色素 ,克服了动植物原料的诸多缺点 , 并且易于实现工业化 2 。因此 ,采用微生物生产天然色素可望逐渐成为天然色素来源的主流。灵菌红素（ prodigiosins， PG）是一类天然红色素的总称，通常都有 3 个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构（见图 1） 3， 1929 年由 Amak 等研究 Serratia 生长时发现，包括 prodigiosin, prodigiosin 25-C， metacycloprodigiosin（ MP） desmethoxyprodigiosin 和 uncedylprodigiosin（ UP）等，是由一些放线菌、沙雷氏菌
3、及其它细菌产生的次级代谢产物 4,5，具有抗细菌、抗真菌、抗疟疾、免疫抑制和抗肿瘤等活性。 PG 的产生在菌体生长代谢过程中的作用目前尚有争议，有学者认为 PG 的产生有利于菌体的生存竞争，但也有学者认为， PG 在菌体生长代谢过程中不起作用，仅为大量初级代谢产物的溢流作用。 图 1 灵菌红素的分子结构 微生物资源的研究和开发越来越受到世界各国的重视， 已成为目前相当括跃的研究领域之一。众所周知，微生物在生态环境中起极其重要的作用，同时又是许多新药物新材料的潜2 在来源 6。需要加强对微生物的研究和开发利用。但由于菌株在自然界中的生长环境有所区别，从生态环境中筛选出的菌株是否跟文献报道一致，需
4、要进一步的分子鉴定。随着分子生物学理论和技术的迅速发展，从遗传进化的角度去认识细菌，从分子水平对细菌进行分类鉴定的方法已日趋完善。应用这些方法对细菌进行分析并配合传统分类鉴定法将使人们在一定程度上更精确地找到所筛选菌株的分类地位。故对从土壤中分离到的一株产黑色素菌株进行分子鉴定。由于该菌所含的黑色素有望作为织物染料、食品添加剂、抗生素等进行开发利用，因此，有必要对该菌进行准确的鉴定。我们通过对 16SRNA基因的测定与分析，从基因水平对所分离的这一菌株进行了分子鉴定 7,8。 2 相关研究的最新成果及动态 现在已有许多种类的微生物被发现可以产生天然色素 ,如需氧光合作用的原核生物、不需氧的向光
5、性细菌、不产孢子真菌和酵母、非致病性和植物病原体细菌、耐盐的淡水藻类等。说明产天然色素的微生物资源是非常丰富的。目前 ,国内外学者还进行了如下工作 913 : 李建波等发现 奇异变形杆菌 ( Proteus mirabilis) 产黑色素能力较大 ； 倪丽姗发现坚强芽孢杆菌 ( Bacillus fumus )BFHM2002 经酪氨酸诱导可显著提高黑色素产量 ； 郑江等从红毛藻中提取藻蓝蛋白 ； 高天荣等从螺旋藻中提取藻蓝色素 ； 瞿文川等从太湖蓝藻中提取叶绿素、胡萝卜素、颤藻黄素和蓝藻叶黄素 ； 马贵武等用螺旋藻制取叶绿素铜钠盐 ； 赵东红等用一株链霉菌 ( Stroptomyces) L
6、S21 发酵可产生蓝色的天蓝菌素 (Coelicolorin)； 袁保红等分离出一株海洋细菌 ( Pseudomonas sp. ) 产灵菌红素 ； 张亮等分离到一株黄杆菌 ( Flavobacterium spp. ) CF260 所产的类胡萝卜素中虾青素的含量为 90.13 %； Del Campo J A 等发现光合自养的绿藻 ( Chlorella zofingiensis) CCAP 211P14 生长时 ,会大量的积累虾青素和叶黄素。 用微生物规模化生产天然色素主要通过化学手段有效刺激色素的生物合成 ,促进生物体内天然色素的积累。许多微生物已经被报道能产生天然色素 ,但是只有一小部
7、分实现工业化。目前杜氏盐藻类是 2 胡萝卜素最闻名的微生 物资源 ,同时雨生红球藻和法夫酵母 (生产虾青素 ) 也是目前仅有的具有大规模工业生产酮类胡萝卜素的微生物系统。三孢布拉霉已经被俄罗斯用于工业生产 2 胡萝卜素多年 14 。改进天然色素的生物合成效率可以增加其产量。不同的培养环境和培养基添加物可以提高微藻、真菌、细菌中的细胞生物量和色素产量。 3 课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标 3 3.1 研究内容 本课题研究的内容是：筛选产黑色素的菌株；提取其基因组 DNA；采用通用引物，扩增 16sRNA 片段；对扩增产物进行测序，在数据库中进行对 比，确定该菌
8、种属，并建立其进化树。基本要求是通过资料查阅要求掌握基因克隆的一般过程和了解研究黑色素生产菌的意义。 3.2 研究方法（技术路线） 首先 ， 菌种来源。从土壤中筛选出几株产黑色素菌株或购买目标菌株。 其次 ， DNA 的制备。运用溶菌酶法或者 CTAB 发提取出发菌株的目的基因 1516配制所需试剂 1718： NaAc（ pH4.6）， TE（ pH8.0）， 10mg/ml 溶菌酶溶液， 20mg/ml 蛋白酶 K 溶液，70%乙醇，酚 -氯仿 -异戊醇（ 25： 24： 1）等试剂。运用溶菌酶发提取基因组 DNA。 第三， PCR 扩增。扩增条件 :94 变性 4 min ,然后 94
9、1 min , 50 1 min ,72 2 min ,30个循环 ,最后 7 延伸 10 min. 扩增得到的产物经 DNA 纯化系统纯化后即可直接作为序列测定的模板 . 于 377 型 DNA 自动测序仪进行直接 PCR 测序 6。 第四，重组质粒制备 1920。将目的基因同购得质粒用相同的限制性内切酶双酶切，加DNA 连接酶连接成重组质粒，后进行阳性克隆筛选。 第五，感受态细胞制备 21-22。严格依照实验指导，用 CaCl2 感受态细胞的制备，在下一步的 重组质粒转化使用。 第六，重组质粒转化。混合质粒悬液和感受态细胞悬液，用热击法使得质粒进行转导。 第七，将基因工程菌接种于 LB 培
10、养基上，培养 36 小时，加一定诱导物，诱导重组基因表达和高产工程菌的筛选。 最后，对表达产物进行性能鉴定。最常用的是 16S rRNA 全序列的测定 23。 4 注 :应用限制性片段长度分析 (RFLP) 、扩增的 rRNA限制性分析 (ARDRA) 、变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 、温度梯度凝胶电泳 (TGGE) 、单链构象多肽性 ( SSCP) 、荧光原位杂交( FISH)方法进行格局 分析。 Note: RFLP,ARDRA,DGGE, TGGE, SSCP and FISH were all used in pattern analysis. 图 1 多相分类法 Fig. 1 Po
11、lyphasic taxonomy 3.3 课题的研究难点 该课题在进行实际操作时，主要的难点是基因组 DNA 的纯度难掌握和 PCR 过程中条件的掌握，因为扩增条件直接影响扩增的 16sRNA 序列 。 3.4 预期目标 在结束该课题时，预期达到的目标是 从对自然界筛选的菌株进行分子鉴定，确定其种属及其亲缘关系。 4 论 文工作进度和安排 2010 年 10 月 23 日 -10 月 30 日：查阅文献资料，确定实验方案。 5 2010 年 11 月 1 日 -12 月 18 日： 继续查阅文献资料，同时做好实验室的器材药品的准备工作。 2011 年 3 月 19 日 -3 月 24 日：
12、准备开题答辩。 2011 年 3 月 26 日 -4 月 20 日：提取基因组 DNA； PCR 扩增、测序，比对，确定该菌种属，并建立其进化树。 2011 年 4 月 20 日 -5 月 19 日：对实验做初步的总结与归纳，并补充相关实验数据。 2011 年 5 月 20 日 -6 月 5 日： 完成毕业论文及答辩 5 参考文献 1 Kim D, Kim JF, Yim JH, Kwon SK, Lee CH, Lee HK. Red to red - the marine bacterium Hahella chejuensis and its product prodigiosin fo
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