1、 1 毕业论文 开题报告 生物工程 用杆状病毒系统表达丙型肝炎病毒结构蛋白 1 选题的背景和意义 全球每年有近一百万人受到 HCV 感染，我国属 HCV 高感染区，人群的丙型肝炎患病率约为 2.1%， HCV 可持续感染患者长达 30 年之久，其中有些患者最终可发展成为肝硬化及肝细胞癌，严重危害人民的生命健康，目前对 HCV 既无有效的治疗药物，也无预防性的疫苗。 杆状病毒是一类双链 DNA病毒，其 DNA是 9.0xl04-2.3x105bp 的环状分子 AcNPV和 BmNPV的 DNA 分子为 1.35X105bP 左右，病毒粒子呈杆状，其感染宿主细 用杆状病毒系统表达丙型肝炎病毒结构蛋
2、白胞后能够产生两种类型的病毒，一种是包涵型病毒 (OV)，又称多角体获得病毒 (PDV),另一种是芽生型病毒 (BV)，或称胞外病毒 (ECV)。在感染的细胞核中，一部分核衣壳外形成囊膜，多角体或颗粒体蛋白沉积于囊膜上，形成包涵体病毒。另一部分核衣壳通过出芽的方式从细胞质膜获得囊膜，形成芽生型病毒。包涵体衍生的病毒主要进行昆虫之间的感染传播，而芽生型病毒则负责昆虫体内感染的扩散。包涵型病毒和芽生型病毒在基因组层次上完全一致，但由于囊膜获得方式的不同，其分子组成略有差别，主要是囊膜 糖蛋白不同，芽生型病毒的糖蛋白为 gP64，而包涵型病毒是 gP41，由于糖蛋白在病毒识别受体和侵染细胞中起重要作
3、用，因此包涵型病毒和芽生型病毒对不同组织细胞有不同感染力 :包涵型病毒对肠中细胞感染力强，适于对昆虫进行喂食感染，而芽生型病毒对体腔中细胞感染力强，感染虫体时须经体腔注射。用杆状病毒系统表达丙型肝炎病毒结构蛋白将为进一步研制适用于人的 HCV 预防性疫苗打下工作基础。 2 相关研究的最新成果及动态 2.1 该项研究的发展历程 杆状病毒发展成一种哺乳动物基因转移载体昆虫杆状病毒表达载体系统的研究始于上世纪80 年代，是继大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统后建立起来的又一高效表达系统。目前用作表达载体的杆状病毒均为核型多角体病毒，以苜蓿银纹夜蛾多核衣壳核型多角体病2 毒和家蚕核型多角体病毒为代表
4、。由于其宿主特异性，一般认为该种高表达载体仅限于介导外源基因在昆虫细胞内表达，在非受纳细胞中不能发挥作用。然而 1983 年， Volkman 等。 发现 AcNPV 能够侵入一些脊椎动物细胞系中，同年和次年， Groener 和 TjiaH 等也分别发表文章报道 AcNPV 可以侵入哺乳动物细胞。此外，在上述三例报道中均未检测到子代病毒产生， 亦无病毒基因组复制表达。以上研究结果表明杆状病毒可以侵入哺乳动物细胞，但是其病毒基因组在哺乳动物细胞中不能复制和转录。这些研究为将杆状病毒发展成为介导外源基因进入哺乳动物细胞表达的新型基因转移载体提供了理论依据。 2.2 在昆虫细胞中装配形成的 HCV
5、-VLP HCV 为单正链 RNA 病毒，基因组 RNA 长约 9.5kb，仅有一个开放读码框架 (ORF)，编码一约 3011 个氨基酸的多聚蛋白前体，该前体蛋自在宿主信号肽酶及病毒蛋白酶作用下，裂解为病毒的结构蛋白与非结构蛋白。 HCV 结构蛋白包括核， c、蛋白 (C)、包膜蛋白 -1(E1)和包膜蛋白 -2(E2)。核心蛋白和 HCV 基因组 RNA 构成核衣壳，在其外面再围上包膜蛋白就组成了完整的 HCV 病毒体 (Virion)。人们一直试图从组织中培养 HCV， Bautenschlager 把截短的 HCV 基因组插入人的细胞，用组织培养，虽表达出 HCV 蛋白，但没有病毒的复
6、制。Rice 等人增加所插入基因片段长度，还有学者用 HCV 的全氏 cDNA 插入人细胞，发现尽管完整的 HCV 基因组能在组织培养中有效复制，但所产生的各种蛋白不能形成病毒粒子，可能是细胞培养中缺少某些能让表达的各个 HCV 蛋白正确地包装出完整 病毒的细胞因子。病毒的分离至今未成功，也未找到合适的体外细胞培养系统。丙型肝炎病毒样颗粒 (Hepatitis C virus like particles， HCV VLP)与天然的 HCV 病毒体不同，它是不含 HCV 基因组、本身不复制而能较好地保留 HCV 抗原性的类病毒颗粒。 2.3 细胞内 HCV 病毒颗粒检测的研究动态 有许多学者尝
7、试建立 HCV 感染细胞模型，并在细胞内检测病毒颗粒。如 Shimizu 等采用对 HCV 易感的淋巴细胞系进行体外培养，在接种后 4 天 -24 天收集细胞，用 RT-PCR 检测负链 HCV RNA(即病毒 复制中间体 )，并以抗 -HCV 核心区和抗包膜糖蛋白单克隆抗体作免疫荧光 (IF)检测，同时作常规电镜 (EM)和酶标记免疫电镜 (IEM)检测。另外，他们还接种了10 只黑猩猩，并于感染后 5 周内开腹取肝组织用 IF 和 EM 检查。结果表明，培养后 6 天可一次性地检出细胞内负链 HCV RNA，即复制中间体，而正链 HCV RNA 则在 3 周内均能测出。培养 12 天后，用
8、 IF 检出细胞质内有核心蛋白和包膜蛋白，第 15 天阳性细胞达 20。3 阳性颗粒呈颗粒状，位于细胞核周围，细胞质小泡内有 50nm 直径的病毒样颗粒，在细胞膜的附近可见病毒样颗粒聚 集。对照细胞和接种后 6 天前的细胞中均未见到类似颗粒。第 15天，用抗核心和抗包膜抗体分别作免疫酶染色，位于核周围的细胞质内可见病毒样颗粒外膜有酶染色反应物包绕，表明抗体与颗粒结合，提示 EM 下所见病毒样颗粒具有 HCV 抗原性。 Mizuno 等将 HCV 全基因组转染 Hela G 细胞，结果用免疫组织化学方法证实细胞中有核心区、包膜糖蛋白区、 NS3 区和 NS5 区等病毒抗原表达。免疫电镜下发现核心
9、抗原定位于内质网膜上，核心抗原阳性颗粒存在于胞浆中，直径 30nm；普通电镜下可在内质网池中发现一直径为 45nm 颗粒，外有包膜包裹。 他们认为， HCV 核心抗原在细胞液中合成和组装。然后在内质网中形成完整的病毒颗粒。 Choo 等研究慢性感染者体内病毒颗粒存在形式与持续感染的关系，发现两种密度梯度的病毒，其包膜糖蛋白高可变区 I(HVRl)序列有差别，以低密度梯度病毒 HVRl 区变异较为显著，并认为免疫压力是造成其基因变异的原因。由于病毒糖蛋白中和抗原表位的基因发生改变，使产生的中和抗体不能结合变异的抗原，这样就不能形成病毒一免疫球蛋白复合物，因而逃避免疫清除作用而持续在体内存在。病毒
10、颗粒特性的研究无疑对进一步揭示病毒的生物学特性，指导抗病毒研究 和发展疫苗均有重要的意义。 3 课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标 3.1 研究内容 ： 本课题所要研究的 用杆状病毒系统表达丙型肝炎病毒结构蛋白，为进一步研制适用于人的 HCV 预防性疫苗打下工作基础。 3.2 采取的研究方法、技术路线 ： 1、引物合成及 HCV 结构蛋白区基因片段的扩增 2、重组转座载体的构建 3、重组杆状病毒穿梭载体的获得 4、重组杆状穿梭载体病毒 Bac-CEE 的 PCR 鉴定 5、重组杆状病毒穿梭载体 Bac-CEE 转染 Sf 9 细胞 6、重组杆状病毒的滴度测定 和
11、接种 7、感染后 Sf9 细胞的收集 4 8、 Sf9 细胞表达的 HCV 结构蛋白的特性分析 9、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析、表达蛋白的抗原性初步测定 技术路线： 3.3 课题的研究难点 ： 杆状病毒传递的外源基因在哺乳动物细胞中表达时间相对较短，有待引入更合适的启动子；和其他病毒载体一样，初次免疫后产生的针对载体的中和抗体可能会在二次免疫时干扰杆状病毒的作用，影响疫苗再次免疫效果；此外，用以研制人用疫苗时，其生物安全性需进一步研究和评价。 3.4 预期达到的目标 ： HCV 结构蛋白能在杆状病毒表达系统中快 速、高效、安全的表达。 5 4 论文工作进度和安排 2010 年 9 月：查
12、阅中英文文献资料，收集杆状病毒系统及其表达病毒结构蛋白方面的研究进展。 2010 年 10 月：制定本实验的研究方案。 2010 年 11 月：完成开题报告的写作及答辩。 2010 年 12 月：完成毕业论文实验相关的仪器和试剂的前期准备。 2011 年 2 月 4 月：毕业论文实验阶段，完成设计的实验过程，得到预期的实验结果。 2011 年 5 月：按照实验过程中记录的实验结果，对比实际结果与预期结果的差异，分析原因，得出结论，完成毕业论文的撰写。 5 参 考文献 1 许信刚，童德文 . 杆状病毒表面展示系统及其应用研究进展 J. 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ), 2009（ 08）
13、。 2 李志勇，殷相平等 . 杆状病毒 /哺乳动物基因转移载体应用于活载体疫苗研究的进展J.中国人兽共患病学报 , 2010（ 03）。 3葛菁萍，高冬妮等 . 杆状病毒 高效蛋白表达载体 J. 中国预防兽医学报， 2009（ 10）。 4 韩庆功，崔艳红等 . 昆虫杆状病毒表达系统在禽流感病毒研究中的应用 J. 吉林农业科学 , 2010（ 01）。 5 沈剑平，朱诗应 . 截短的丙型肝炎病毒核心蛋白基因和绿色荧光蛋白基因在 Sf9 细胞中的融合表达 J. 临床检验杂志 , 2009（ 04）。 6 朱诗应 , 戚中田 . 丙型肝炎病毒样颗粒疫苗的研究现状 J. 国外医学 .预防 .诊断 .
14、治疗用生物制品分册 , 2005,(01) 。 7王瑞青 , 梁昌镛 , 焦成松 , 宋建华 , 陈新文 . HCV 结构蛋白在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒的组装 J. 中国病毒学 , 2005,(01) 。 8邱丰等 . 丙型肝炎病毒亚单位融合蛋白的表达及免疫原性测定 J. 中华实验和临床病毒学杂志， 2010（ 4）。 9赵四海等 . 丙型肝炎病毒研究模型的现状与未来 J.浙江大学学报， 2007,36（ 6）：614-618。 . 6 10廖小玲，戚中田 . 丙型肝炎疫苗的研究进展 J.免疫学杂志， 2005（ 6）， 21（ 3）： 25-27。 11赵玮 . HCV 结构蛋白基因的表
15、达及在昆虫细胞中形成病毒样颗粒的研究 D.北京：中国医学科学院， 2002。 12刘文宇，戚中田 . 丙型肝炎疫苗的研究进展与挑战 J.国际生物制品学杂志， 2010（ 8） ,33（ 4）： 180-186。 13侯刚，张欣欣 . 丙型肝炎预防性和治疗性疫苗的研究进展 J.流行病学传染病分册，2004（ 8）， 31（ 4）： 201-203。 14李菲 . 杆状病毒系统表达丙型肝炎病毒结构蛋白 D.东北：东北农业大学， 2002。 15Nanda S et al. Hepatic transcriptome analysis of hepatitis C virus infection in chimpanzees defines unique gene expression patterns associated with viral clearanceJ. PLoS ONE. 2008,(10) 。 16 Fukushima H et,al. Development of a novel preparation method of recombinant proteoliposomes using baculovirus gene expression systemsJ. Journal of biochemics,2008(10)。
