1、 1 毕业论文 文献综述 生物工程 天然色素发酵工艺优化 摘要： 灵菌红素（ PG）是一类含甲氧基吡咯骨架结构的天然色素，是一些放线菌、沙雷氏菌及其他细菌的次级代谢产物，具有免疫抑制、抗肿瘤、抗细菌、抗真菌和抗疟疾等多种生物活性； 还介绍了灵菌红素在医学、环境、纺织等方面的应用以及其发展和现状。 关键词： 灵菌红素 天然色素 抗肿瘤 灵菌红素（ prodigiosins）是一类天然红色素的总称，通常都有 3 个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构，包括 prodigiosin,prodigiosin25-C,metacycloprodigiosi（ nMP） desmethoxyprodigiosi
2、n和 uncedylprodigiosin（ UP）等，是由一些放线菌、沙雷氏菌及其它细菌产生的次级代谢产物 1,2，具有多种如抗肿瘤、抗细菌，抗疟疾，抗真菌和抗原生动物等活性 PG 属于脂溶性色素，易溶于甲醇和丙酮，不溶于水； PG 对温度稳定但受 pH 的影响较大； A1， Ca， K ， Ba 等金属离子对 PG 的稳定性影响不大， Zn 有使 PG 增色的作用， Mg 和 Mn 对 PG 有一定的破坏作用 。 3 现阶段，主要是通过微生物发酵来获得灵菌红素，能产生灵菌红素的微生 物主要有链霉菌属（ Streptomyces）、沙雷氏菌属（ Serratia）和假单胞菌（ pseudom
3、onas）等种属。 4人们的研究主要集中在沙雷氏菌属其抗肿瘤方面；此外，由于其无毒抗菌性能，可以作为一种绿色的饲料添加剂或食品添加剂，且由于其是一种天然色素，可以作为纺织工业中的染料；甚至韩国方面还将它应用于赤潮的治理工作。 1 灵菌红素活性研究 1.1 抗肿瘤作用 Montaner 等 5。 6的研究表明，灵菌红素能诱导人结肠腺癌细胞株 DLD-1 和 SW-620 及人胃癌细胞株 HGT-1 凋亡，对转移性肿瘤 细胞株 SW-620 更为有效，其诱导结肠癌细胞凋亡呈剂量依赖性，主要表现为细胞收缩、染色质缩合、肌动蛋白微丝结构重组等。 Montaner 等认为，灵菌红素色素通过诱导 p38-
4、MAP 激酶（ p38-MAPK）的磷酸化而促使细胞凋亡。 Songia7 等则认为，灵菌红素通过抑制视网膜母细胞瘤易感基因（ retinblastoma， Rb）的磷酸化作用与抑制细胞周期蛋白酶 2 和 4（ Cdk-2， Cdk-4）阻滞人淋巴细胞的增殖。 Yamamoto 等 8将灵菌红素的抗肿瘤作用归因于能促使 H+和 Cl-的同向跨膜转移， 引起空泡型2 H+-ATP 酶（ V-ATPase）解离，使胞液酸化引起凋亡。 Castillo-Avila 等 9研究了灵菌红素对结肠癌细胞溶酶体内 pH 值及细胞繁殖周期的影响，结果表明，灵菌红素 促使溶酶体内 pH 升高，结肠癌细胞株 HT
5、29 的繁殖被阻滞在 G1 期，支持了Yamamoto 等胞液酸化从而引起凋亡的观点。但此观点备受争论，其焦点是胞液酸化在细胞凋亡中能起到多大作用。 Melvin 等 10。 11认为，灵菌红素对肿瘤细胞的杀灭作用与其核酸酶特性相关。由于灵菌红素富含电子而被氧化并还原 Cu 2+， 引发铜离子诱导的双链 DNA 裂解，表现出细胞毒活性 Subramanian 等 12从微球菌（ Micrococcus sp.）分离出灵菌红素结构类似物具有核酸酶特性及抗肿瘤活性，实验表明，此化合物能有效地与 DNA 结合，促进铜离子介导的 DNA 裂解及膜脂质过氧化，对鼠源淋巴瘤细胞株 EL4 和人源慢性骨髓瘤
6、细胞株 K562 有显著细胞毒活性，抑制瘤细胞的增殖。 Zhang 等 13研究了灵菌红素对胰腺恶性肿瘤细胞株 8898 的抑制作用， MTT 法得到的实验结果说明：灵菌红素在较低的浓度下即可对 8898 胰腺 癌细胞的增殖产生明显抑制，与非肿瘤细胞的Swiss-3T3 细胞的平行实验表明：灵菌红素对肿瘤细胞具有一定的特异性抗细胞增殖的作用，而非肿瘤细胞对于灵菌红素的作用敏感性较低。 1.2 免疫抑制剂活性 14 链霉菌属和沙雷氏菌生产出红色物质包括灵菌红素 metacycloprodigiocin， prodigiosene，methoxyprodigiosin和灵菌红素 25 - C。具有
7、抗疟疾的抗菌活性，尤其是灵菌红素 25 - C显示了抑制免疫的作用。灵菌红素对 T淋巴细胞的免疫反应有抑制效果，灵菌红素在其有效浓度 范围没有显示毒性。因此，灵菌红素可以用来作为免疫抑制或在各个领域的标准物质，包括免疫疾病的治疗需要，器官或组织移植和免疫细胞为基础的疾病研究 1.3 抗菌作用 灵菌红素具有抗细菌（ antibacterial）、抗真菌（ antifungal）的生物活性。 Cang 等 15以沙雷菌发酵生产的 灵菌红素 做抗菌实验，结果表明，对芽孢杆菌具有显著地杀灭作用。灵菌红素 结构类似物具有显著的抗 Tri-chophyton spp.等真菌的活性，在临床测试中表现出对 C
8、occidmycosis 引起的一种地方性真菌传染病有良 好的治愈作用。 1.4 抗疟疾活性 Isaka 等 16从 Streptomyces spectabilis BCC 4785 的发酵产物中分离得到的 MP 有显著的抗疟疾活性。体外实验表明，其抑制 Plasmodium falciparum K1 的 IC50 为 0.005 0 0.001 g/mL。尽管多种灵菌红素类似物在动物模型中表现出了抗疟疾活性 3 此外，灵菌红素能保护海洋细菌免遭太阳辐射损害或原生动物侵蚀，具有抗 Dinoflagellates 的活性，灵菌红素对引起查格斯疾病的锥虫（一种寄生虫）有很大的杀伤作用， 其杀锥
9、虫活性（ IC50=5 mol）是经典杀锥虫药 Nifurtimox 活性（ IC50=150 mol）的 30 倍。灵菌红素可作为生物农药用于防治 Botrytis cinerea 等引起的樱草属植物病害。 灵菌红素具有强烈的细胞溶解酶活性，能杀灭引起赤潮的浮游藻类 17，将其撒在赤潮中， 1/10的浓度 1h 就能杀灭导致赤潮的大部分浮游生物。灵菌红素有望通过毒性实验和环境影响检测，成为治理赤潮的产品。 2 灵菌红素的生产现状 1996 年 D Alessio 等 18提出了新的制备灵菌红素类似物的方案，先将 C 环和 B 环相连然后再和 A 环结合（以往模拟生物合成路线是先将 B 环和
10、A 环相连）即得 灵菌红素 前体物质，步骤简单，合成效率明显提高，但不能用来合成天然的十二烷基灵菌红素。 陶金莉等通过紫外线氯化锂复合处理灵菌红素生产菌沙雷氏菌 (Serratia sp1) W 0206 ，用高浓度葡萄糖为碳源的选择性平板定向筛选抗葡萄糖分解代谢物阻遏的高产株 ， 筛得高产突变株 B220 ，相对于原始菌株 ， B220 摇瓶发酵灵菌红素产量提高了 3 倍 ， 5 L 反应器上的产量提高了63 %19。 Tao 等 20紫外诱变获得了一株沙雷菌株 B6，以葡萄糖为初始碳源，流加甘油为 灵菌红素 合成诱导物，所开发的流加发酵工艺不仅可防止菌体过早自溶，而且可部分消除 灵菌红素
11、产物的抑制作用，将 灵菌红素 的合成能力提高了 7.8 倍，达 583mg/L。 Wei 等 22以改进的 LB 培养基，提高胰蛋白胨和酵母膏的浓度并去除了 NaCl 发酵沙雷菌生产灵菌红素，约比 LB 增产 3 倍，达 152mg/L；在培养基中添加 2% 6% 的植物油，如豆油、棕榈油、葵花子油等可促进灵菌红素的合成，最高达 790 mg/L，表明灵菌红素合成 与胞外生物表面活性剂的存在有关。在 YE 培养基中添加含吡咯环的脯氨酸、组氨酸和天冬氨酸可显著促进 UP 的合成。当添加 10g/L 的脯氨酸时，产量可达 2.5g/L。 Cang 等从土壤中分离获得一株沙雷菌 S389，以乙醇为唯
12、一碳源，灵菌红素 产量最高可达 2.95g/L。 Giri 等 23在黏质沙雷菌的培养基中分别添加花生籽粉、芝麻粉、咖啡粉，均能显著增加灵菌红素产量，其中以添加花生籽粉最为显著，达到 38.75g/L。 袁保红 24将从广东大亚湾海水中分离的红色海杆菌（ Rhodomarinobacter sp.）的发酵条件进行了优化。李厚金 33对从大亚湾海水中分离的 pseudomonas.sp 的 GYP 液体培养基中选用自来水，20%， 50%， 80%， 100% 海水作介质对照研究 NaCl 在 灵菌红素 产生中的作用。结果表明，盐度4 越高细菌菌体生长和色素产生的速度越快。 Nakashima
13、等 25研究用细菌 -proteobacterium 生产灵菌红素时发现 -proteobacterium 同样具有quorumsensing（ QS）系统， N-acyl homoserine lactones（ N - A H L ）是此系统的一种关键性物质，在发酵中通过控制 N-AHL 的浓度可提高 灵菌红素 的产量。 20 世纪 80 年代以来，人们开始从基因水平研究 灵菌红素 的生物合成途径及其调节， 1983 年Feitelson 等 26克隆了天蓝色链霉菌与灵菌红素合成相关的基因簇， Thomason 等 27则首次将分离得到的 Serratia 灵菌红素生物合成基因转入欧文氏菌
14、（ Erwinla carotovora）质粒，成功表达并得到了灵菌红素。 3 灵菌红素的应用前景 首先，医学上抗肿瘤作用。 PG 对比起 另外一些化学疗法药剂，如 环磷琉胺 （ cyclophosphamide）具有低细胞毒作用，只有当浓度大于 300nM 时才具有明显的淋巴细胞抑制作用。而后者在其有效浓度时毒性已非常高。 28 它能在 铜 离子配合下破坏癌细胞的双链 DNA。而癌细胞相比非癌组织具有较高的铜离子浓度（ 3.5 倍），这也成为 PG 对癌组织高针对性的基础。 PG 还 可以通过抑制细胞中型拓扑异构酶 I 和 的活性而进一步达到破化 DNA 复制的目的。 PG 可破化细胞内的
15、线粒体 ， 高尔基体 和 溶酶体 对细胞质的 pH 梯度，降低细胞内 ATP 水平。这是由于 其 可以在这些细胞器的膜上起到离子孔的作用，而抵消氢氯离子的同向转运。 灵菌红素可以激活细胞内 细胞凋亡 途径。一方面，灵菌红素激活前半胱天冬酶 8，继而启动了细胞内半胱天冬酶依赖的细胞凋亡。另一方面，它也可以使线粒体释放其细胞凋亡诱导因子（ AIF）而触发非半胱天冬酶依赖的细胞凋亡。 其次，在环境治理上，韩国科学家于 1996 年首次在海洋中发现一种微生物 “ 哈赫拉 ”（ Hahella）。基因组测序分析后发现 其 能产生可以清除赤潮的灵菌红素。将灵菌红素撒在赤潮中，只需十亿分之一的浓度， 1h
16、后就能将导致赤潮的浮游生物大部分杀死。这对 治理河湖的富营养化及海里的赤潮，维护地球环境具有 重大 意义。 韩国科学家已为 其 申请了韩国和国际专利。 29 再次，作为 食品添加剂，合成色素发明之后，天然色素逐渐被取代。随着毒理学和分析技术的不断发展和人们生活水平的提高，发现某些合成色素食用过量有致癌危险，而天然色素具有较高的安全性 。可是 ， 天然色素不能满足现代食品工业发展的需要，开发新品种 以及改进原有 的天然色素（如灵菌红素）迫在眉睫。 最后， 在纺织业方面，现如今，随着人们生活水平的提高，人们对安全，健康，绿色的产品需5 求日益扩大，为了满足社会 需求，特别是内衣，汗衫，袜子等生产能
17、够抗菌的纺织物是将来发展的一大趋势 。 30 综合上述，不难看出灵菌红素在抗肿瘤，抗菌方面具有一定的疗效，随着生物操作技术的发展和对灵菌红素的深入研究，其在抗肿瘤方面显示的其巨大的药用潜力被不断发掘。但对其未来具体在医药或者其他领域的应用还有待深入研究拓展。还需要更加深入了解灵菌红素的产生和作用机制，解决未来需要的大量生产制备具体应用等等问题。相信不久以后灵菌红素必定可以在造福人类。 参考文献 1Shieh.W Y, Chen.Y W, Chaw.S M, et al. A red,facultativelyanaerobic,marine bacterium isolated from se
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