1、 1 毕业论文 文献综述 生物工程 -淀粉酶的研究及应用 淀粉酶是一种 水解酶 ，是目前 发酵工业 上应用最 广泛的一类 酶 。淀粉酶一般作用于 可溶性淀粉 、直链淀粉 、 糖原 等 -1,4-葡聚糖，水解 -1,4-糖苷键的酶。根据作用的方式可分为 -淀粉酶 （ EC3.2.1.1.）与 -淀粉酶 （ EC3.2.1.2.）。因 -淀粉酶 作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开 -1,4 糖苷键，生成糊精和还原糖，而 -淀粉酶从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断 -1,4-葡聚糖链生成分子量比较大的极限糊精 ，且 -淀粉酶 分布更广泛，已是一种十分重要的酶制剂， -淀粉酶大量应用于粮食加工、食
2、品工业、酿造、发酵、和医药行业等，它占了整个酶制剂市场份额的 25%左右 1。目前工业生产上都以微生物发酵法大规模生产 -淀粉酶。但随着社会需求的增大 ， 工业生产对 -淀粉酶的需求量也越来越大 ， 急需寻找满足生产需要的具新型特征的酶制剂。因此本文主要讨论以 -淀粉酶为代表的淀粉酶的研究及应用。 1 -淀粉酶的研究 1.1 -淀粉酶分离纯化方法的研究 高纯度 -淀粉酶是一种重要的水 解淀粉类酶制剂 ， 可用于研究酶反应机理和测定生化反应平衡常数等。分离纯化 -淀粉酶的方法很多 ， 一般都是依据酶分子的大小、形状、电荷性质、溶解度、稳定性、专一性结合位点等性质建立的。要得到高纯度的 -淀粉酶
3、， 往往需要将各种方法联合使用。盐析沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析和电泳等 ， 是蛋白质分离纯化的主要方法。用吸附树脂法、 40%乙醇从 -淀粉酶发酵液中分离高活性 -淀粉酶，用离子交换法和透析法对初酶液进行脱盐处理，最后用 DEAE纤维素纯化 淀粉酶，所得酶活力为 60153U/g，酶活性 回收率为 66.04%2。另通过乙醇沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析等方式 ， 从白曲霉菌 A. kawachii 的米曲粗抽出液中 ， 分离纯化到两个耐酸性 -淀粉酶比活性极高的组分。用疏水吸附法和DEAE-cellulose(二乙氨基乙基 -纤维素 )柱层析法分离纯化 -淀粉
4、酶 ， 所得酶活力为 110 000 U/g。用硫酸铵沉淀和垂直板制备凝胶电泳对地衣芽孢杆菌 A. 4041 耐高温 -淀粉酶进行分离纯化 ， 得到 3种电泳均一的组分。通过超滤、浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳 ， 对利用基因工程菌生产的重组超耐热耐酸性 -淀 粉酶进行纯化 ， 得到电泳纯级的超耐热耐酸性 -淀粉酶 ， 纯化倍数为 11. 7，活力回收率为 29. 8%3。但上述方法存在的共同问题是 ， 连续操作和规模放大都比较困难。双水相技术具有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点。应用双水相系统 PEG/磷酸盐分离2 纯化 -淀粉酶 ， 增加 PEG 浓度有助于酶富集上相
5、。同样用 PEG/磷酸盐双水相体系从发酵液中直接萃取分离低温 -淀粉酶 ， 分配系数及回收率分别为 4. 8 和 87%4。 PVP(聚乙烯吡咯烷酮 )和硫酸铵对酶活力具有保护作用 ， 利用 PVP/硫酸铵液 -固萃取体系分离 提取耐高温 -淀粉酶 ， 酶活力回收率高 ，体系成相时间短 ， 操作时不需双水相体系所用的分液漏斗和离心操作 ， 用倾液法即可实现相分离 ，因此 ， 与双水相体系相比 ， 液 -固萃取体系具有更大的优越性 5。 1.2 -淀粉酶活力测定方法的研究 测定 -淀粉酶活力的方法已不少于 200 种 ， 其共同之处是 ， 被测样品与某种多糖底物溶液保温反应后测之 ， 很难标准化
6、。碘 -淀粉比色法测定 -淀粉酶活力的优点是 ， 操作简便 ， 试剂便宜 ， 比色精确、敏感。因此 ， 成为受推荐的淀粉酶活力测定方法。盛勤芳 6提出要提高糖化型淀粉酶活力测定的准确性须 注意酶反应时间的选择和酶的控制。严控制测定时间十分重要，为了保证 10min 内（初速度时间范围内） 50 ，底物（淀粉液）必须预保温 5-10min。为了能得到准确的测定结果，在实验设计中，对空白与样品滴定值之差（ B-A）一般控制在 1.0-2.6ml；若（ B-A）小于 1.0ml，表明酶浓度过小；若（ B-A）大于 2.6ml，表明酶浓度偏高。（ B-A）这个值可以通过调整酶的稀释倍数，使之控制在 1
7、.0-2.6ml 范围内。 1.3耐高温 -淀粉酶的研究 大多数淀粉酶生产的研究是以 25-37 7， 8的温度范围的中温菌开 展的。但是为了节约生产成本，-淀粉酶最好在高温糊化（ 100-110 ）和液化（ 80-90 ）过程中保持活性，因此有必要寻找耐更高温度的耐高温 -淀粉酶。 生产耐高温 -淀粉酶的菌种有地衣芽孢杆菌、枯草杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、凝聚芽孢杆菌、酸热芽孢杆菌以及普通高温放线菌等。解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌是最常用在温度 37-60 9生产淀粉酶的芽孢杆菌。海洋红嗜热盐菌，作为一种海洋嗜热菌产生 -淀粉酶最高耐热温度为 61 10。用随机整
8、合法在地衣芽孢杆菌中表达了耐高温 -淀 粉酶基因 ， 筛选出的阳性菌中 -淀粉酶基因表达水平比供体菌提高了 20 倍 11。对超嗜热菌强烈火球菌的 -淀粉酶 PFA 基因序列进行密码子优化在巴斯德毕赤酵母中高效表达，得到 -淀粉酶活力最高为 220 U/L12。 1.4耐酸性 -淀粉酶的研究 目前 ， 国内外市场中常用的淀粉酶为中温、高温以及碱性 -淀粉酶 ， 在酸性条件下 ， 其酶活性降低很明显 ， 甚至失去活性。随着我国淀粉质原料深加工工业的发展 ， 工艺条件的不断改变 ， 一些淀粉原料深加工工艺需要在较低的 pH 值条件下进行。所以 ， 开发新型耐酸性 -淀粉酶迫在眉睫。 自 1963
9、年日本学者首次发现耐酸性 -淀粉酶以来 ， 能产生耐酸性 -淀粉酶的微生物大多为芽3 孢杆菌和曲霉。从酒曲中选育得到的嗜酸性的黑曲霉产酶菌株 Tx-78，通过液体发酵 ， 酒精沉淀以及二次离子交换层析得到最适 pH 为 4. 0， 最适反应温度为 70 ， 具有良好的耐酸性和热稳定性的耐酸性 -淀粉酶制剂 13。蔡恒等 14把 -淀粉酶的基因改造后 ， 克隆到穿梭质粒 pBE2 中 ， 构建了含突变 -淀粉酶基因的分泌型诱导表达载体 pBSAT， 含有 pBSAT 的菌株可将突变 -淀粉酶分泌到胞外 ， 分泌的 -淀粉酶具有较高的耐 酸性。 2 淀粉酶的应用 2.1 在食品工业中的应用 各种酶
10、制剂在食品工业中的应用已有上百年的历史 ， 最近几十年 -淀粉酶广泛地应用于焙烤工业中 -淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大 ， 纹理疏松；提高面团的发酵速度 ;改善面包心的组织结构 ， 增加内部组织的柔软度；产生良好而稳定的面包外表色泽 ;提高入炉的急胀性；抗老化 ，改善面包心的弹性和口感；延长面包心储存过程中的保鲜期。 目前 ， 焙烤工业使用的 -淀粉酶主要来自大麦麦芽、真菌和细菌。 1955 年 ， 美国批准真菌 -淀粉酶作为面包添加剂。 1963 年 ， 英国证实了它们的安全性 15。现在 ， -淀粉酶已经在全世界范围内使用。 2.2 在造纸工业中的应用 淀粉酶在造纸工业中的用途主
11、要是改良纸张涂层淀粉，由于造纸施胶过程中要保持淀粉乳的粘度 ， 压扎机也要根据所造纸的级别来调整施胶的粘度 ， 而且天然淀粉的粘度较高需经处理降低其粘度后才能用于表明施胶 ， 因此需要用 -淀粉酶间歇式或连续降解淀粉来调整淀粉乳的粘度。 2.3 在清洁剂生产中的应用 酶是现代高效清洁剂的成分之一。酶在清洁剂中最大的功能就是使清洁剂更温和无害。早期的自动洗碗机的清洁剂非常粗糙，容 易在进食时对人体造成伤害，而且对陶瓷、木质餐具也会造成损害。而将酶制剂用于清洁剂以后 ， 可以在较低的清洗温度下就到达很好的清洗效果。 1975 年 ， -淀粉酶开始用于洗衣粉中。现在 ， 几乎 90%以上的液体清洁剂
12、中都含有 -淀粉酶 16。 2.4在医药行业中的应用 从最早的 J. Takamine 博士第一个使用米曲霉进行 -淀粉酶工业生产，这一淀粉酶被称之为塔卡淀粉酶作为一种助消化剂开始，淀粉酶在医药行业的应用主要是作为助消化剂 17。黑曲霉 -淀粉酶因具有耐酸性 ， 适用于制造助消化的药物 ， 开发适合于胃酸性环 境 (pH2. 0 左右 )的耐酸性 -淀粉酶 ，用于制备消化助剂 ， 将会使医疗效果更为有效 18。另外分析血链球菌群中的细菌与 -唾液淀粉酶的结合能力 ， 可有效鉴定不同血链球菌群中各菌株。研究唾液 -淀粉酶与致龋血链球菌粘附的关系 ，4 为龋病的病因学研究和预防提供了理论依据 19
13、。 3 结论 综上所述， -淀粉酶是使用最广泛的酶之一。除食品和淀粉行业对它们的需求不断增加，同时它们也用在诸如纸张纸浆、清洁剂和医药等其他行业。由于应用领域的扩大，对特异性的淀粉酶的需求越来越多。许多研究者对其进行了深入的研究，现 研究重点放在了发展微生物 -淀粉酶的耐热性和耐酸碱性上，这将扩展其使用的范围 ， 提高使用效率。无论如何 ， 随着科技的发展、研究的深入 ， 淀粉酶将会得到更加广泛的应用。 参考文献 1 孙晓菲 ,李爱江 -淀粉酶的应用及研究 J畜牧兽医科技信息， 2008(6):13-14 2 凌家俭 ,王宁 ,王林涛高活性 -淀粉酶的分离与纯化 J苏州大学学报 (医学版 )2
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