1、毕业论文 文献综述 生物工程 生物自显影技术简介 一、前言 目前， 从天然产物中筛选、分离和提取天然抗菌成分已成为天然防腐剂和新药研发等研究领域的热点，筛选得到的产物往往需要进行生物活性鉴定，传统的鉴定方法需要在整个动物或者是器官上进行，这样不仅需要大量的活体实验体，还需要大量的目标提取物，实验过程复杂，操作要求高，无法满足实验要求，这样就使得我们去寻找并建立灵敏、方便、快捷且经济的活性检测方法，目前都采用微量生物活性物质的鉴定方法，如酶法 1，微生物抑菌法，免疫原法等，这些方法都有各自的特点，适合于不同实验 ，本篇文献介绍一种操作简单、耗费低、灵敏度和专属性高的生物活性检测方法，生物自显影法
2、，并简要介绍该方法的几种分类和应用。 二、主题 1、 TLC生物自显影技术简介 普通生物自显影技术是一种利用薄层色谱来对生物活性进行测定的方法，薄层色谱是一种分离色谱，他能将天然产物初提物中的活性成分和非活性成分在薄层板上很好的分离并展开，再通过与混合了微生物（各种真菌，致病菌，病原微生物）的培养基相接触，通过一定的手段培养，培养基上会出现两个不同的区域，一个是被微生物覆盖的区域，即非活性区域，另一个出现抑菌圈的地方则是活性区 域，相对薄层板上的展开位置就是生物活性物质的所在，通过洗脱剂可将其收集。再参考该物质的标准展开样板，则可得知该物质的化学结构，分子式等信息。 2、 TLC生物自显影技术
3、的分类 2 2.1 琼脂扩散法 琼脂扩散法是较早的一种生物自显影法，其操作步骤就是最原始的步骤，所需要注意的是，在实验过程中可在培养基中加入一定量的四挫盐（如 MTT， INT等），四挫盐本身颜色较浅，但是它在接触了微生物的代谢产物之后会变成深色，有助于我们的判断，还有一点就是如果薄层板采用的是硅胶吸附剂，那么可以在硅胶和培养基之间放置一张湿润的 滤纸，因为琼脂有粘性， 它与硅胶层接触后会产生黏着，会破坏抑菌圈的观察。 2.2 直接 TLC生物自显影法 该法与上述方法的区别是它的载体由培养基变成了薄层板，用特制培养液培养细菌制成菌悬液，然后将菌悬液喷洒在展开完成的薄层板上，一定潮湿避光的条件下
4、培养一定时间，同样加入一定量的四挫盐，但是该方法只适用于那些能在薄层板上很好生长的真菌类微生物。 2.3 琼脂覆盖法 琼脂覆盖法是上诉两种方法的综合，它是以薄层板为载体，但不是采用喷洒式，而是将融有菌的琼脂熔融液均匀覆盖到薄层板上，等到琼脂凝固后再在一定的条件下培 养，用四挫盐染色后，就可以观察到结果，该方法的优点是实验过程对结果的影响较小，可以放心大胆的实验。 3、新型高效生物自显影技术 3.1 HPTLC生物自显影技术 3 高效薄层色谱（ HPTLC）生物自显影技术，他在薄层板的制作上加以改进，它采用粒度分布很窄的微粒硅剂（ 5-10um）制备高效薄层板，用程序多级展开或圆形展开技术使薄层
5、色谱的灵敏度和分辨率大大提高。相对于 TLC色谱，他有以下优点：（ 1）分辨率提高，分辨率与吸附微粒的半径的平方成反比。（ 2）分析时间变短，展开速度与吸附剂颗粒半径成正比，故颗粒越小， 展开速度越慢，但是由于分离效率大大提高，所以分析时间还是变短。（ 3）检出灵敏度增加。 3.2 二维生物自显影技术 所唯二维生物自显影技术就是一个薄层，两次展开的意思，。 Wedge4等先用极性展开剂将薄层板展开 , 调转 90后再用非极性展开剂第 2次展开 , 这样在一块薄层板上就同时展开了极性和非极性成分。相对于二维薄层色谱， TLC法有以下不足 5：一维薄层色谱不易将成分复杂的样品完全分离，致使抑菌斑点
6、的归属不清；不能将活性成分完全从薄层板中转移至培养基中，尤其会影响含量较少和不易扩散活性成分的表达；活性成 分扩散到培养基后，由于平板培养基较厚，活性成分可扩散的空间较大，不易形成位置准确、轮廓清晰的抑菌斑点。 4、主要操作方法 4.1 薄层板的制备 薄层板制备主要在与吸附剂与支持剂的选择，根据被测化合物的吸附能力，化学结构等的不同，可以分为硅胶吸附剂，氧化铝吸附剂，聚酰胺吸附剂，薄层板在商店里已有出售。 4.2 展开剂的选择 同样展开剂的选择除了根据被测物质化学性质的不同而不同外，还要考虑被测物的极性，吸附剂的极性，一般主要选用的是低沸点的有机溶剂，且一般都不单一的使用一种溶剂，而往往采用两
7、种或两种以上 的溶剂按照一定的比例来配比后使用，常以三元溶剂较为常见，第一元是与被分离物溶解度很小的，第二元是对被分离物溶解度很大的，第三元是调节两溶剂比例的。展开剂选择完成后还可以对他进行优化。 展开剂的选择是一个需要摸索，工作量大的步骤，我们必须根据不同配比展开剂展开效果的对比来确定展开剂组分。 4.3 含菌培养基的制备 首先要对菌液进行稀释，根据国际标准可以选取稀释倍数为 10 -5到 10 -7倍，具体的倍数根据实验测试而定，培养完成后可在其中加入染色物质，如四挫盐，或是碱性品红溶液，以 方便观察。 4.4 点样与展开 点样量同样是一个需要确定的值，不同的点样量会有不同的抑菌效果，并不
8、是越多越好，点样完成后让其自由展开 4.4 生物自显影 即将展开完成的薄层板与制备完成的培养基接触，让薄层板上的活性物质通过扩散效果到培养基上，在一定条件下培养，培育完成后可得到含有抑菌圈和不同背景颜色的培养基，根据其相对位置确定薄层板上的位置，然后提取该物质。 三、总结 随着人类对化学药品危害的认识，天然生物药物已经逐渐崭露出蓬勃的趋势，所以，快速，简便，有效的分离方法也将在未来分离技术中占据着重要的位置，生 物自显影技术虽然才发展了几十年，但由于其优越的性能与特点，已经成为了生物分离技术的主攻点。掌握好生物自显影技术，并加以改善和精进，对人类健康，寿命，对社会稳定发展等都有其非凡的意义 。
9、 四、参考文献 1 Choma I, Grenda D, MalinowskaI, etal . Determination of flumequine and doxycycline in milk by a simple thin-layer chromatographic method J . J Chromatogr B, 1999, 734(1) : 7-14. 2 曲建博，娄红祥，范培红 TLC 生物自显影技术在药物筛选中的应用 J 中草药， 2005， 13(1)：132-138 3 刘欣，郝淑贤，赵力超 荸荠英抑菌成分活性跟踪方法的研究 J 食品科学， 2005， 26(7):
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