1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 神经性药物与血清白蛋白相互作用的光谱学研究 所在学院 专业班级 环境工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘 要 蛋白质是生命有机体的重要组成部分，它几乎参与了所有的生命过程。药物小分子在人体血液中与血浆载 体蛋白的相互作用直接影响药物的分布、排泄、代谢、活性和毒副作用。本文讨论了药物分子与血清白蛋白相互作用的模式，解释了该模型形成的原因及影响因素；通过荧光光谱法揭示药物分子与血清白蛋白相互作用的荧光猝灭机制、结合常数、结合数、作用力类型以及药物分子对蛋白质构象的影响等，从而能够为生命科学、医药学的提供药物与蛋白质相互作用时药
2、物在生物体内的吸收、分布、排泄、代谢、转化的各种信息。 关键词： 神经性药物、血清蛋白、相互作用、光谱分析 II ABSTRACT Protein is an important part of life organism, it almost attended all life process. Drug small molecules in the blood in the body with plasma carrier protein interaction directly affect drug distribution and discharge, metabolism, act
3、ivity and side effects. This paper discussed the drug molecules and serum albumin interaction model, explains the model the reason and influencing factors; Through the fluorescence spectrometry reveal drug molecules interact with serum albumin destroyed the fluorescence cu, combined with constant me
4、chanism, the number, reaction type and drug molecule protein conformation of the influence to wait, so it can be for life science and medicine to provide drugs and protein interactions drugs in the biology absorption, distribution and excretion, metabolism, transformation of all kinds of information
5、. Keywords: neurological drug, serum protein, interaction, spectral analysis 目录 摘要 Abstract 1 绪论 （ 1） 1.1引言 . （ 1） 1.2血清白蛋白的功能 （ 1） 1.3神经性药物与血清白蛋白相互作用模式 （ 2） 2 实验部分 （ 3） 2.1 材料和仪器 （ 3） 2.2 实验流程 . （ 3） 2.3 分析方法 . （ 3） 2.4 实验内容 . （ 3） 3 结果与分析 （ 5） 3.1 荧光分析 （ 7） 3.2 紫外分析 （ 10） 4 结 论 （ 14） 致谢 （ 15） 参考文献
6、 （ 16） 1 1 绪论 1.1 引言 研究血清白蛋白与药物分子的相互作用。对于阐明药物机理，药物动力学和药物毒理非常重要。对于进行药物分子设计、开发新药等也具有重要指导意义 1。 分子生物学和分子药理学的发展使人们能够从基因水平理解某些疾病的发病机理，并 通过分子设计来寻找有效的治疗药物。因此，上世纪 90 年代以来，药物小分子蛋白质相互作用的研究已成为化学和生命科学热门课题之一 2。当药物进入人体后，总要通过血浆的贮存与运输达到受体部位，进而发生药理作用。血清白蛋白是血浆中最为丰富的蛋白质，它能与许多内源及外源化合物结合，并能结合生物体内存在的多种微量元素 3。进行药物小分子蛋白质之间的
7、相互作用研究不仅有助于从分子水平上阐述药物的作用机理，而且对抗癌、抗病毒药物的体外筛选具有重要的意义，同时也为设计更有效的抗癌、抗病毒药物提供了理论指导和有价值的信息 4-6。 荧光光谱法是研究小分子与血清白蛋白相互作用的主要手段，也是目前研究较为活跃的方法。蛋白质中色氨酸、酪氨酸的存在使其具有内源荧光，在 345nm 处有最大荧光峰。随着药物的加入，牛血清白蛋白 (BSA)的荧光强度有规律的降低，说明药物对 BSA有荧光猝灭作用。根据猝灭曲线可以求得药物与 BSA的结合常数，确定猝灭类型 7。根据荧光光谱和吸收光谱可获得药物与或 BSA 的结合位点数，及药物与 HSA、BSA上色氨酸残基的距
8、离，根据反应焓变、熵变确定它们之间的相互作用力 。本文用苯妥英钠与 BSA相互作用，苯妥英钠英文名 Phenytoinum Natricum ,别名为大伦丁，化学名是 5,5-二苯基 -2,4-咪唑烷二酮钠盐，苯妥英钠的分子式为 C15H11O2N2Na。 图 1.1 苯妥英钠的 结构 式 2 1.2血清白蛋白的功能 血液携带机体所需要的氧、蛋白质、糖类、脂 肪、维生素、水和电解质等。血浆蛋白与多种物质结合成复合物，便于在血液中的运输。其中白蛋白与脂肪酸结合，使其成为水溶性；它也可以与一些小分子物质 (如激素 )呈可逆性的结合，防止它们从肾脏流失，并通过结合态和游离态之间的动态平衡，维持血液中
9、这些物质浓度相对稳定8。机体细胞必须依靠血液在组织液与各内脏器官之间进行有效的水分、热量和物质交换，才能通过内脏器官的活动来维持内环境稳态。正常人血清渗透压约为 5330mmHg。血清蛋白的分子质量大，所产生的渗透压小，不超过 25 mmHg，称为血清胶体渗透压，它可以维持血管 内外的水平衡。血清胶体渗透压主要来自白蛋白。若白蛋白明显减少，血清胶体渗透压也将明显减少。血清 pH值主要决定于血清中的白蛋白和它的钠盐组成的缓冲对，所以人血清白蛋白及其它无机盐缓冲对协同缓冲了血清的酸碱变化 9。 1.3 神经性药物与血清白蛋白相互作用模式 药物小分子与血清白蛋白之间的相互作用主要有氢键、范德华力、静
10、电引力、疏水作用力等。氢键为 和负电性原子或原子团共价结合的氢原子与邻近的负电性原子（往往为氧或氮原子）之间形成的一种非共价键 10。在保持 DNA、蛋白质分子结构和磷脂双层的稳定性方面起重要作用。分子 间作用力被称为范德华力，按其实质来说是一种电性的吸引力。 疏水力在蛋白质多肽链的空间折叠、生物膜的形成、生物大分子之间的相互作用以及酶对底物分子的催化过程中常常起着关键的作用。非极性分子之间或分子的非极性基团之间在水环境中相互吸引并聚集在一起，而把原来处在非极性基团附近的水分子排挤出去，结果使周围水分子的熵值增加 11-14。这种相互作用力可以促使蛋白质大分子在其接近表面的地方折叠形成一定的裂
11、隙构造，形成无水的微环境，这有时对于酶与底物分子结合或受体与配体分子的结合是必需的。 3 2 实验部分 2.1 材料 和仪器 实验仪器 相关仪器 型号 厂家 分子荧光分光光度计 Gary Eclipse Varian 紫外分光光度计 UV-2550 SHIMADZU CORP 电子天平 AL204 METTLER TOlEDO 实验药品 药品 分子式 厂家 苯妥英钠 C15H11O2N2Na 上海联试化工试剂有限公司 三羟甲基氨基甲烷（ Tris） (HOCH2)3CNH2 北京鼎国生物技术有限公司 牛血清白蛋白 V（ BSA） 北京鼎国生物技术有限责任公司Genview分装 盐酸 HCl 衢
12、州巨化试剂有限公司 NaCl NaCl 宁波市化学试剂有限公司 2.2 实验流程 配制 Tris-HCl 缓冲溶液用于体系的稀释剂，配苯妥英钠溶液和 BSA溶液准备液，不同苯妥英钠浓度对苯妥英钠与 BSA 相互作用的影响，通过分子荧光光谱分析予以讨论。 2.3 分析方法 荧光分析法 紫外分析法 4 2.4 实验内容 2.4.1 配制 0.1mol/L 1L PH=7.4 Tris-HCl缓冲液（ Tris-HCl 0.1mol/L ; HCl 0.1mol/L; NaCl 0.1mol/L） 2.4.2 配制 2.010 -5 mol/L BSA溶液（以 Tris-HCl缓冲液为稀释剂） 配制
13、 1.010 -2mol/L 苯妥英钠溶液（以 Tris-HCl缓冲液为稀释剂） 2.4.3 准备 5支 10ml 容量瓶标为 0、 1、 2、 3、 4.，各加入 BSA溶液 1mL，再分别对应滴加 0、 1、 2、 3、 4（ ml）头孢溶液，其余用 Tris-HCl溶液滴定至刻度。摇匀，放置数小时。 2.4.4 对 5个样品在 25C 下进行荧光分析 、紫外分析 。 5 3 结果与分析 3.1 荧光分析 蛋白质的内源荧光主要来自于分子中的色氨酸残基和酪氨酸残基 15-16。在 280 nm光激发下， BSA分子中的内源荧光发射峰位于 340 nm附近。图 3.1为固定 BSA浓度，体系荧
14、光发射光谱随苯妥英钠的量的变化。从图 3.1中可见，随着加入的苯妥英钠量的增加，峰形无显著变化，但发射波长有蓝移趋势，荧光强度有规律地降低，说 明苯妥英钠对 BSA的荧光有猝灭作用 17。 图 3.1 苯妥英钠对 BSA 荧光猝灭光谱 3.1.1 确定结合常数 Kq 为了确定此猝灭过程的机制，先按动态猝灭过程处理，那么服从 Stern-Volmer方程： )(1)(1 00 QckQckFF dq (1) 其中 F0为猝灭体不存在时的荧光强度， F为加入猝灭体后的荧光强度， kq为双分子猝灭常数， c(Q)为猝灭体浓度， 0为猝灭体不存在时荧光体的荧光寿命 (实验测得 0的值6 在 1 10 ns之间，为了计算方便，一些文献取 0值为 1 ns，另一些文 献取 0=l0ns，本文中取 0=1 ns)， kd为 Stern-Volmer常数，以 F0/F -1对 c(Q)作图，得到如下的结果，如图 3.2-3.4 2 4 6 80 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .3 5DL i n e a r F i t o f D a t a 1 _ DF0/F-1c(Q ) m o l / L图 3.2 苯妥英钠对 BSA 荧光猝灭的 Stern-Volmer 曲线（ 25 ）
