1、1埃博霉素的生物合成与埃博霉素 D 内酰胺衍生物的半合成研究阎家麒（湖北荆工药业有限公司，湖北 京山 431800）摘 要 粘细菌纤维堆囊菌 ATCC15384 在发酵培养中使用 P450 埃博霉素环氧酶的一种抑制剂，该抑制剂特异性抑制 epoK 基因产物的生成。重组纤维堆囊菌的 epoK 基因因随机诱变而失活，由于埃博霉素聚酮合酶（PKS）基因编码的改变，生产菌株只产生埃博霉素 D 和 C，而不产生埃博霉素A 和 B。快速色谱纯化得到埃博霉素 D，以其为起始材料采用区域性- 立体选择性钯催化大环内酯氮化反应半合成埃博霉素 D 内酰胺衍生物。关键词 埃博霉素 D 内酰胺衍生物；埃博霉素 D；粘
2、细菌纤维堆囊菌；生物合成；埃博霉素基因簇；聚酮合酶埃博霉素 (epothilones）是 16 元大环内酯化合物。它们首先被 G.Hofle 及其同事从粘细菌纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum,Myxococcales)中分离提取出来 1，主要成分为埃博霉素 A 和 B，结构式如图 1 所示。它们在该菌中以 2:1 的比例产生，被认为是一类新型天然存在的微管解聚抑制剂。尽管在结构上和紫杉醇并不相同，但它们在作为微管聚合和微管稳定剂方面有相似的作用机理。与紫杉醇相比，埃博霉素不但具有水溶性好，注射、口服均可的特点，而且在 P-糖蛋白表达型的多药耐药性 （MDR）细胞中也维持很大
3、的细胞毒性，埃博霉素被公认为本世纪将取代紫杉醇的最有效的抗癌药物。Fig 1 Structures of epothilones A,B and Taxol作者简介：阎家麒，1939 年生，男，辽宁营口市人，教授，中国药学会高级会员，主要研究领域：生物制药和复杂结构天然药物有机合成。联系电话：13469789911， E-mail: 2由于埃博霉素全合成步骤繁琐且产率甚低，凸显生物合成的可实施性。埃博霉素的生物合成屡见报道 2-5，但产率低微尚无工业化应用价值。目前，已有 5 种埃博霉素类似物进入 II 和 III 期临床试验，它们是埃博霉素 B、埃博霉素 D、Ixempa（ixabelilo
4、ne ） 、ZK-EPO和 BMS-310706。埃博霉素 D 内酰胺衍生物(Aza-epothilone D)是一种埃博霉素重要的衍生物，实验证明它具有较强的抑制微管解聚功能 6, 是一种候选抗癌药物。埃博霉素 D 内酰胺衍生物结构式如图 2：Fig 2 Structure of Aza-epothilone D作者以粘细菌纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum ）ATCC15384 为出发菌株，使用一种化学合成的抑制剂，使得 epoK 基因（P450 环氧酶）发生突变，得到一个含有失活epoK 基因的纤维堆囊菌突变菌株,在埃博霉素生物合成的后修饰过程中，抑制 C12-C13
5、环氧化反应，使得埃博霉素 C 和 D 向埃博霉素 A 和 B 的转化受到遏制，因而只产生埃博霉素 C 和 D 而不产生埃博霉素 A 和 B。然后，以色谱纯化后的埃博霉素 D 作为起始原料，经区域性- 立体选择性三苯基膦钯催化大环内酯氮化反应，促使埃博霉素 D 开环，得到一种氮酸，再经三甲基膦处理，生成亚氨基正膦，经水解成为氨基酸。最后用 HOBt-EDCl促进氨基酸环化反应，得到标的的埃博霉素 D 内酰胺衍生物。1 材料与方法1.1 菌种和 EpoK 抑制剂出发菌株为粘细菌菌株中的纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum）ATCC15384, 从美国菌种保藏中心得到。epoK 抑制
6、剂为 1-(2-甲基-4-噻唑基)-2-甲基己基-1-烯-5-炔-3-乙酸酯，依据文献 8方法合成。31.2 培养基与菌株突变 出发菌株接种在固体培养基上，固体培养基成分为：大豆蛋白胨 8g/L，马铃薯淀粉20g/L，酵母提取物 10g/L , 无水葡萄糖 5g/L，CaCl 2H2O 1g/L, MgSO47H2O 1g/L, Fe-EDTA 8mg/L, 琼脂粉 15g/L。30培养 5d 后，接种至液体发酵培养基。液体发酵培养基成分为：大豆蛋白胨 10g/L，马铃薯淀粉 20g/L，酵母提取物 4g/L , 无水葡萄糖15g/L， CaCl2H2O 1g/L, MgSO47H2O 1g/
7、L, Fe-EDTA 8mg/L，树脂 XAD-16 20ml/L。30，120r/min，摇床培养 4d。加入 epoK 抑制剂，使终浓度为 5.0mmol/L 至10.0mmol/L, 在 30下，120r/min，摇床继续培养 7d。1.2.1 检测培养物中产生的埃博霉素 D 和埃博霉素 C取培养物 50ml，用尼龙筛（孔隙 150m）过滤，用少量水冲洗保留在尼龙筛上的树脂，然后与滤膜一起置于 50ml 离心管中，加入异丙醇 10ml，密封。以 180r/min 摇动 1h，将埃博霉素洗涤下来，然后离心分离 1.5ml 溶液，将约 0.8ml 上清液用移液管转移到 HPLC 试管中。依据
8、样品的 HPLC 分析结果确定埃博霉素 C 和 D。在上述相应菌落的部分平皿上用塑料杯将 1cm2 琼脂区域的细胞转移到 10ml G52 培养基（马铃薯淀粉 8g/L, 葡萄糖 2g/L，脱脂大豆粉 2g/L，酵母浸膏 2g/L，Na-FeIII-EDTA 8mg/L, CaCl22H2O 1g/L, MgSO47H2O 1g/L, HEPES 11.5g/L,用 KOH 调节 pH 7.4）中，在 30，180r/min 条件下培养 7d。将培养物 5ml 转移到 250ml 锥型烧瓶中的 50ml G52 培养基中，在 30，180r/min培养 3d。第一次基因突变获得了缺失 epoK
9、 基因的只产生埃博霉素 C 和 D 的突变菌株。1.3 突变菌株发酵生产埃博霉素 D连续种子培养：从液氮中取出的 1ml 冷冻突变菌种接种到 10ml 的 G52 培养基中，并在 30，180r/min，25mm 位移条件下培养 3d。将 5ml 种子培养物加入到 45ml 的 G52 培养基中生长 3d。然后将此 50ml 的培养物加入到 450ml 的 G52 中生长 3d。以后每 34d ,以 10%接种量将 50ml 种子培养物接种到 450ml 的 G52 培养基中，以进行连续的种子培养。20 L 中间种子培养：在 30L 发酵罐中装 18L G52 培养基，接种前种子培养液2L，3
10、0 ，250r/min，0.5L 空气 /L/min, 过压为 0.5bars 条件下培养 3d 培养 34d，加入10ml 硅树脂消泡剂，防止泡沫形成。250L 发酵培养：1B12 培养基（马铃薯淀粉 Noredux A-150(Blattmann, Waedenswil, Swizerland) 2%, 脱脂大豆粉 Soyamine 50T(Lucas Meyer, Hamburg, Germany) 1.1%, 4EDTAiFe(III)-Na 盐（8g/L）1ml, 用 KOH 调节 pH 为 7.8.）150L 装入 250L 发酵罐，加入2%XAD-16 后进行灭菌，接种 15L
11、中间种子培养物。在 30、200r/min、0.5L 空气/L/min, 过压为 0.5bars 用硫酸控制 pH 值 7.60.5 条件下发酵培养 67d。产品分析：取样 50ml, 用 150m 孔径的尼龙筛滤得树脂，弃滤液。用去离子水洗涤树脂 23 次。加入 10ml 甲醇摇动 30min，取 2ml 离心后的上清液用于 HPLC 分析。样品注射通过 4.610mm 的保护柱中，然后以从 35%到 100%乙腈的梯度，以 1ml/min 的流速，在 UV250nm 下 10min 内通过一个长分离柱（4.6150mm, Inertsil, ODS-3,5m） 。埃博霉素D 在 9.9mi
12、n 时洗脱出来，埃博霉素 C 在 9.1min 洗脱出来，而埃博霉素 A 和 B 分别在6.5min 和 7.3min 洗脱出来。从 250L 发酵培养物中分离代谢产物：过滤收集 XAD-16，水洗涤后，用甲醇洗脱，减压蒸除溶剂，用乙酸乙酯抽提余下的水相，减压蒸干，然后均溶于甲醇中，滤除不溶物，将溶液上 Sephdex LH20 柱，甲醇洗脱，将含目的物的馏份浓缩至干并再次溶于甲醇中，上快速色谱（C18 反相硅胶，1020m ） ，柱床预先用 3 体积 50%甲醇平衡，上样后依次用50%、 55%、 60%、65%甲醇洗脱。馏份用 UV 检测仪 250nm 检测。将目的馏份埃博霉素D 减压至干
13、，得到埃博霉素 D，一种白色结晶。1.4 半合成埃博霉素 D 内酰胺衍生物埃博霉素 D （98g，199.4mmol)和叠氮钠（15.54g，240mmol)悬浮于 THF-H2O(5:1) 混合液 1.92L 中，用氮脱气 20min，然后用催化量三苯基膦钯（24g，19.94mmol) 在氩气下处理，反应混合物升温至 45，1h，再冷至 25。反应混合物呈嫩黄色均相溶液，该溶液用 1.0M 三甲基膦-THF 溶液（THF498ml,498mmol）在 25下处理，在室温下搅拌 2h。得到一种氨基酸。上述氨基酸混合物用 MeCN-DMF (20:1) 9.0L 稀释，冷却至 0，先用 1-羟
14、基苯并三氮唑（HOBt） （27g，199.4mmol)后用 EDCI （95.6g，498mmol)处理，反应混合物升温25，搅拌 12h。用乙酸乙酯萃取（4L4 ）,有机层依次用水 8L、饱和盐水 8L 洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残留物上动态轴向压缩色谱（硅胶，2%甲醇-氯仿洗脱） ，得到埃博霉素 D 内酰胺衍生物 31.6g(33%)，一种白色固体，纯度98%。2 结果与讨论2.1 埃博霉素生物合成5粘细菌的纤维素堆囊菌原始菌株目标产物产率低，采用基因突变方法定向选育高产菌株，较之传统诱变育种方法，更具应用与大规模生产埃博霉素类抗癌药物的可能。埃博霉素生物合成主要是由 I 型聚酮合
15、酶（PKS ）催化完成的, 埃博霉素的复合酶系统中同时含有 PKS 和 NRPS(非核糖体肽合成酶)摸块，包括 1 个负载摸块，1 个非核糖体肽合成酶摸块，8 个聚酮合酶摸块和 1 个能把脱氧埃博霉素转变成环氧埃博霉素的 P450 环氧酶 7。整个基因簇中有 7 个转录方向一致的基因（EpoA, EpoB, EpoC, EpoD, EpoE, EpoF和 EpoK)，9 个模块和 46 个结构域。埃博霉素生物合酶全长约 56kb，埃博霉素生物合酶依照转录顺序依次是：epoA(149-kD, 编码 1 个负载模块 ) epoB(158kD, 1 个 NRPS 模块) epoC(193kD,1 个
16、 PKS 模块 2) epoD(765kD，4 个 PKS 模块 3-6) epoE(405kD, 2 个 PKS 模块 7 和 8) epoF(257kD,1 个 PKS 模块 9 加 1 个硫酯酶) epoK(47kD,1 个细胞色素 P450)， 同时由于 epoA/epoB, epoC/epoD 中存在基因的重叠现象，推测 epoA/epoB, epoC/epoD 可能共转录。而在 epoB/epoC(147bp), epoE/epoF(15bp)和epoF/epoK(115bp) 基因之间短小的间区序列中没有发现转录终止子，这表明所有这些基因可能是由一个异常大的操纵子（56kb）构成
17、。根据同位素 13C 标记实验结果和合成酶全基因簇功能的推测，埃博霉素的生物合成包括 5 个阶段：聚酮链的引发：在酰基转移酶的作用下，活化载体蛋白，形成活化中心。链合成的起始和噻唑环的形成：在 epoA 和epoP 模板的共同作用下催化乙酰基和半胱氨酸，缩合形成埃博霉素合成的特殊起始物2-甲基噻唑五元杂环。链的延伸和转移：埃博霉素骨架每经过一个模块就有一个二碳单元结合到聚酮链上，并加以适当的修饰。在延伸阶段，埃博霉素骨架依次经过 epoC（1 个PKS 模块） 、epoD（4 个 PKS 模块） 、epoE （2 个 PKS 模块）和 epoF（1 个 PKS 模块） ，共经过了 8 个模块，
18、形成了埃博霉素的 16 元骨架。链合成的终止释放和环化：在进行到epoF 的末端的时候，16 元环的骨架从活化位点转移到 epoF 末端区域中硫酯酶的丝氨酸位点上，终止了链的合成。在环化酶的作用下，自身分子内环化，解离形成 16 元大环内酯类化合物。产物的后修饰:埃博霉素基因序列中的 P450(epoK)是由 420 个氨基酸组成，氨基酸序列与细胞色素 P450 氧化酶的同源性很高，它催化埃博霉素 C12-C13 之间的环氧化，使埃博霉素 C 和 D 环氧化成为埃博霉素 A 和 B。突变该基因，可以使埃博霉素的合成停留在 C 和 D 上 7(图 3)。6Fig 3 Epothilone bio
19、synthesis. Modular organization of the epothilone polyketide synthas(PKS). Functional domains of each of the epothilone PKS modules are shown. Stepwise synthesis of epothilones begins at EpoA and ends with the cyclization by the TE domain in EpoF to yield either epothilones Cand D or the hypothetica
20、l molecule containing the OH group at C-13. Abreviations: KS, -ketoacyl ACP synthase; Ksy, -ketoacyl ACP synthasecontaining a tyrosine substitition of the active-site cysteine; AT, acyltransferase; DH, dehydratase; ER, enoylreductase; KR, ketoreductase; MT, mrthyltransferase; ACP, acyl carrier prote
21、in; TE, thioesterase; C, condensation; A, adenylation; PCP, peptidyl carrierprotein.2.2 epoK 抑制 剂本文以纤维堆囊菌 ATCC15384 为出发菌株，使用一种化学合成的 epoK 的抑制剂突变epoK 基因产物 -细胞色素 P450 环氧酶，所采用的 epoK 抑制剂为 1-(2-甲基-4-噻唑基)-2-甲基己基-1-烯-5-炔-3-乙酸酯(图 4)，依据文献 8方法合成。7Fig 4 Structure of epoK inhibitor由于新菌株缺乏 epoK 环氧酶功能，因而抑制了 C12-C1
22、3 环氧化反应，使得埃博霉素C 和 D 向埃博霉素 A 和 B 的转化受到遏制，该菌株只产生埃博霉素 C 和 D，而不产生埃博霉素 A 和 B。埃博霉素 D 内酰胺衍生物的半合成通过区域性-立体选择性钯催化亲核取代反应而实现的。以埃博霉素 D 作为起始原料，与催化量的四（三苯基膦）合钯（ O）合叠氮化钠作用，在 45，反应 1h，使埃博霉素 D 大环开环，趋于形成 -烯丙基钯络合物，得到一种单一的非对映异构体，即氮酸，氮酸经三苯基膦处理，生产氨基酸化合物，最后用 1-羟基苯并三氮唑（HOBt）-EDCI 和固体碳酸氢钠促进氨基酸环化反应，得到埃博霉素 D 内酰胺衍生物（图 5） 。Fig 5
23、Pd(o)-catalyzed nucleophilic substitution reaction to the regio- and stereoselective semisynthesis of aza-epothilone D83 小结1、纤维堆囊菌（以 so ce90 为例） ，无论采取驯化或是 UV 和 NTG 诱变育种，只能有限地提高埃博霉素 A 和 B 的产量，而埃博霉素 C 和 D 产量极少。本发明的纤维堆囊菌采用 epoK 抑制剂，突变 epoK 基因产物-细胞色素 P450 氧化酶, 使纤维堆囊菌中的 epoK 失活，该突变菌株可以定向获得埃博霉素 D 和微量埃博霉素
24、C，而不产生埃博霉素 A 和 B。2、以分离得到的埃博霉素 D 为起始材料， 经钯催化亲核取代反应反应实现大环内酯化即得到埃博霉素 D 内酰胺衍生物，合成路线短，产率高（ 21.5%） ，该方法具有工业规模生产埃博霉素的价值。参考文献：1. Gerth KN, Bedorf G, Hofle H, et al. Epothilne A and B: Antifungal and cytotoxic compouds from Sorangium cellulosum (myxobacteria)-Production, physico-chemical, and biological prop
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29、84 in the presence of an inhibitor of a P450 enzyme (an epothilone epoxidase), which is a specific inhibitor of the epoK gene product. The recombinant Sorangium cellulosum in which the epoK gene has been inactivated by random mutagenesis and so produces only epothilone D and C, does not produce epot
30、hilone A or B, duo to an alteration in the genes 9coding for the epothilone polyketide synthase (PKS). The purified epothilone D by flash chromatography, as a start material, using a concise regio- and stereoselective Pd(o)-catalyzed azidation reaction of a macrocyclic lactone provided the desired aza-epothilone D.Key word aza-epothilone D, epothilone D, Sorangium cellulosum, biosynthesis, epothilone gene cluster, polyketide synthase
