1、哈尔滨工业大学学士学位论文 工学学士毕业论文 几丁质对海洋生防酵母 (Rhodosporidium paludigenum)抑菌活性的影响及相关机理的研究 哈尔滨工业大学 2010 年 6 月 哈尔滨工业大学学士学位论文 食品科学与工程工学学士毕业论文 几丁质对海洋生防酵母 (Rhodosporidium paludigenum)抑菌活性的影响及相关机理的研究 导 师 ： 申请学位级别： 工学学士 学科、专 业 ： 食品科学与工程 所 在 单 位 ： 海洋学院 答 辩 日 期 ： 2010 年 6 月 授予学位单位： 哈尔滨工业大学 哈尔滨工业大学学士学位论文 A Thesis for the
2、 Degree of B. Eng 错误 !未指定书签。 Impact and Mechanism of Chitin on the Marine Yeasts Antibacterial Activity Candidate： Supervisor： Guangfeng Kan Academic Degree Applied for： Bachelor of Engineering Specialty： Food Science and Engineering Date of Oral Examination： June, 2010 University： ： Harbin Institut
3、e of Technology 哈尔滨工业大学学士学位论文 摘要 I 摘 要 生物防治是采用微生物菌株或抗菌素类物质，通过喷洒或浸渍果实处理，以降低或防治果实采后病害的保鲜方法。本实验通过利用酵母细胞壁组分 之 一 几丁 质 诱导培 养 本 实验 室 分离得 到 的 拮抗 菌 株海洋 酵 母Rhodosporidium paludigenum Fell Chitin; Induction; BCPD哈尔滨工业大学学士学位论文 目录 1 目 录 摘 要 . ABSTRACT . 第一章 文献综述 . 1 1.1 我国水果产业发展概述 . 1 1.2 果蔬采后病害的侵染研究 . 1 1.2.1 采
4、后病原真菌的侵染方式 . 1 1.2.2 采后病原真菌的致病机理 . 2 1.3 果蔬采后病害的控制方法 . 2 1.3.1 化学杀菌剂的使用 . 3 1.3.2 果实采后病害防治物理方法 . 3 1.3.3 果实采后病害生物防治 . 4 1.4 采后拮抗酵母作用机制 . 4 1.4.1 营养和空间的竞争 . 4 1.4.2 重寄生作用 . 5 1.4.3 胞外活性物质的产生 . 5 1.4.4 诱导抗性 . 6 1.4.5 抗生作用 . 6 1.5 拮抗菌生理调控及机理的研究 . 7 1.5.1 逆境培养 . 7 1.5.2 拮抗物质的分泌和积累 . 8 1.5.3 基因工程技术的应用 .
5、8 1.6 本课题研究目的 . 8 1.7 应用前景和学术价值 . 9 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 对果实采后真菌病害抑制效果研究 . 10 2.1 前言 . 10 2.2 实验材料和方法 . 10 2.2.1 主要仪器 . 10 2.2.2 拮抗菌及 其培养 . 11 2.2.3 病原菌培养和孢子悬浮液的制备 . 11 2.2.4 试剂 . 11 哈尔滨工业大学学士学位论文 目录 2 2.2.5 果实选择与预处理 . 12 2.2.6 几丁质对 R. paludigenum 生防效果的影响 . 12 2.2.7 数据处理分析与作图 . 13 2.3 结 果 . 13 2.
6、3.1 不同浓度几丁质对 R. paludigenum 生防效力的影响 . 13 2.3.2 几丁质诱导后不同浓度 R. paludigenum 酵母的生防效果 . 15 2.3.3 不同培养时间对几丁质诱导下 R. paludigenum 生防效力的影响 . 17 2.3.4 几丁质与 NaCl 结合诱导对 R. paludigenum 生防效力的影响 . 18 2.4 讨论 . 20 第三章 海洋酵母 R. paludigenum 对果实采后真菌病害抑制机理研究 . 22 3.1 前言 . 22 3.2 实验材料和方法 . 22 3.2.1 主要仪器 . 22 3.2.2 拮抗菌及其培养
7、. 23 3.2.3 病原菌培养和孢子悬浮液的制备 . 23 3.2.4 果实选择与预处理 . 23 3.2.5 几丁质对 R. paludigenum 生防机理的影响 . 23 3.2.6 数据处理分析与作图 . 24 3.3 结果 . 24 3.3.1 几丁质对 R. paludigenum 在果实伤口处生长动态的影响 . 24 3.3.2 几丁质处理后 R. paludigenum 对果实诱导抗性的影响 . 26 3.3.3 几丁质处理后 R. paludigenum 发酵上清液的抑菌效果 . 27 3.3.4 几丁质培养后 R. paludigenum 对果实 POD 酶活性的影响 .
8、 27 3.4 讨论 . 28 第四章 结果与展望 . 30 4.1 本论文的主要研究结果 . 30 4.2 本实验的后续 研究及展望 . 30 致谢 . 32 参考文献 . 33 附 录 . 37 哈尔滨工业大学学士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 1.1 我国水果产业发展概述 水果是维生素、矿物质和膳 食纤维的重要来源，是人们维持身体健康，增进营养必不可少的主要食品 ， 是世界上仅次于粮食的农产品 。中国是世界水果生产大国， 总收获面积和产量以及多种水果的产量均居世界首位。蔬菜、水果产业是我国国内仅次于粮食产业的第二、第三大产业。 2007 年 3 月国家统计局发布的中华人
9、民共和国 2006 年国民经济和社会发展统计公报显示， 2006 年我国水果总产量为 17050 万吨。据 2010 年初步统计， 2009 全国水果面积约 1.6 亿亩，与上年基本持平，产量 1.2 亿吨，同比增 9 。 根据联合国粮食组织对 50 多个国家的调查，发展中国家水果收获后的平均损失率在 30%以上。我国水果因采后处理技术落后，作为产量第一大国，水果腐烂损失也高居全球榜首。根据一般保守 的估计，我国水果采后损失为20% 30左右。据此估算，我国每年水果采后的经济损失将达到数百亿元人民币的水平。 导致果实采后损失的因素很多，主要包括： (1)由于采前栽培管理、采收和采后处理技术不当
10、而造成的损失； (2)由于果实采后水分和营养消耗造成的失重和枯萎等品质劣变而引起的损失； (3)由于采后逆境造成的果实生理代谢失调而引起的损失； (4)由于采后成熟衰老造成果实组织结构崩溃而引起的损失；（ 5）由于病原物侵染造成的腐烂损失等。 由各种病原物引起的植物病害每年都给各国经济造成重大的损失，其中又以真菌性病害 最为严重。据估计，仅美国每年由真菌性病害造成的经济损失就达 330 亿美元（ Maor 和 Shirasu, 2005； Strange 和 Scott, 2005）。真菌也是引起采后果实病害的主要病原物（ Sholberg 和 Conway， 2004）。病原真菌不仅会造成果
11、实数量上的巨大损失，而且许多病原真菌分泌产生的大量次生代谢产物还可能会引起严重的食品安全问题，如曲霉菌（主要是 Aspergillums flavus和 Aspergillums parasiticus等）产生的黄曲霉毒素、扩展青霉（ Penicillium expansum）产生的棒曲霉素（ patulin）等（ Martins et al., 2002； Sholberg 和Conway, 2004； Dombrink-Kurtzman 和 Blackburn, 2005； Brodhagen 和 Keller，2006； Morales et al., 2007）。 1.2 果蔬采后病害
12、的侵染研究 由真菌病害引起的果实采后的腐烂变质是导致水果大量损失的主要原因之一。病原真菌不仅会造成果实数量上的巨大损失，而且许多病原真菌分泌产生的大量次生代谢产物还可能引起严重的食品安全问题。 哈尔滨工业大学学士学位论文 第一章 文献综述 2 1.2.1 采后病原真菌的侵染方式 采后病原真菌主要通过 3 种途径或方式入侵果实： (1)通过机械伤或虫害等造成的伤口； (2)通过自然开放的皮孔、气孔、果实和花梗结合部位； (3)通过分泌寄主细胞壁水解酶等直接突破果实表皮的防御机制（ Prusky 和Lichter, 2007）。病原菌孢子一旦接触伤口组织，侵染就开始了（ Janisiewicz和
13、Korsten, 2002； Prusky 和 Lichter, 2007）。而在没有伤口等便利的入侵途径的情况下，许多采后病原真菌的孢子可能会长时间潜伏在果实表面，直到果实成熟和衰 老后才发起对果实的攻击（ Prusky 和 Lichter, 2007）。 1.2.2 采后病原真菌的致病机理 采后病原真菌具有众多而且复杂的致病机理，但其最终目的都是成功的侵染寄主。病原真菌分泌产生的寄主细胞壁分解酶是研究较多、机理较为明确的重要致病因子，其主要包括多聚半乳糖醛酸酶（ polygalacturonase）、果胶裂解酶（ pectatelyase）、木聚糖酶（ xylanases）、木糖苷酶（ x
14、ylosidase）、蛋白酶（ protease）、葡聚糖酶（ glucanases）、漆酶（ laccase）等 (Snchez-Torres和 Gonzlez-Candelas， 2003； Akimitsu et al., 2004)。这些酶可能涉及病原真菌多方面的侵染机制和过程，如渗透、组织泡软、营养获得、改变寄主生理等 （ Snchez-Torres 和 Gonzlez-Candelas, 1996； Akimitsu et al., 2004）。 1.2.2.1 致病菌酸化果实组织 P. expansum、 P. digitatm 和 P. italicum 等酸性病原真菌能产生柠
15、檬酸和葡萄糖酸等有机酸，使寄主果实组织发生酸 化，进而促进病原菌致病因子，如 PG 基因（ pepgl）的表达（ Prusky et al., 2004）。 1.2.2.2 致病因子 CAT 活性氧（ Reactive Oxygen Species， ROS）在植物和微生物相互作用过程中具有重要作用（ Torres et al., 2006)。最近，中科院植物所 Qin 等 （ 2007）利用蛋白组学技术发现，硼酸盐抑制扩展青霉的机理与硼酸盐抑制该真菌体内参与清除 ROS 的过氧化氢酶（ Catalase， CAT）及谷胱甘肽 S-转移酶（ Glutathione S-transferase）
16、等有关，暗示扩展青霉产生的 CAT 等可能也是该病原菌的一个致病因子。 1.2.2.3 病原菌破坏植物自身防御机制 植物在遭到病原菌侵染时，通过体内木质素和羟脯氨酸糖的沉积，植物抗菌素的积累，蛋白质酶抑制剂和溶菌酶的合成来增强细胞壁的保卫反应。另一方面，病原真菌在侵染过程中能诱导激发果实组织的形态和生理、分子水平发生显著变化（ Kim et al., 2001; Snchez-Torres and Gonzlez-Candelas, 2003）。目前的一些研究显示，病原菌能够刺激果实 SOD、 PAL、 POD 等 与抗病性密切相关的酶活性，分解果实自身抗菌物质，诱导果实几丁质酶和-1,3-葡
17、聚糖酶活性，以及刺激相关基因的表达（ Yakoby et al., 2001） 。 哈尔滨工业大学学士学位论文 第一章 文献综述 3 1.3 果蔬采后病害的控制方法 果蔬贮藏保鲜是果蔬生产减损、保值和增值的关键因素。特别是当果蔬受到机械损伤后，病原菌更容易进入伤口，导致病害的发生，所以有必要利用一些防治手段保护这些损伤位点，防止果蔬在储运过程中进一步的腐烂变质。根据国内外的研究报道，控制采后病害非杀菌剂的方法主要可分为生物学方法、物理方法和化学方法 3 大类。 1.3.1 化学杀菌 剂的使用 目前，化学杀菌剂是防治果蔬采后真菌病害的主要手段之一。化学杀菌剂在全世界范围广泛使用，在欧洲和亚洲占农
18、药市场的 26%，但在美国只占6%。 随着国家经济发展和消费水平的提高，人们对食品安全和环境保护意识的增强，化学杀菌剂的使用范围越来越受 到 限制。 有许多研究报道，化学杀菌剂具有一定的毒副作用。 美国国家科学院（ NAS）的报道（ 1987）指出，杀菌剂的应用造成了人类健康的危害性，全美 9 种致瘤化合物的销售量占所有杀菌剂的 90%左右，在用于食品的全部农药中，杀菌剂构成 60%的致癌危险。这一报道导致了几种杀菌剂 如克菌丹（ Captan）和苯菌灵（ Benomyl）等被美国环保机构所禁用，并部分或全部的自动退出采后应用市场。 此外由于长期使用杀菌剂，病原菌进化 并 产生了大量抗药性菌种
19、。 因此，找到一种新的安全的可以替代化学杀菌剂，控制果蔬采后病害的新方法具有非常重要的意义。 1.3.2 果实采后病害物理防治 果蔬采后病害防治物理方法主要有：热处理；低温冷藏 ； 微波处理；气调；辐射处理；低压处理。低温冷藏技术已经在部分地区得到实际运用，热杀菌和辐照杀菌也是目前报道比较多的方法。 低温冷藏是一种常用的保鲜技术。近几年来，低温冷藏技术 又有新的发展，采用临界点低温高湿存储，即控制在物料冷害点温度以上 0.5 1 和相对湿度为 90 98的环境中存储保鲜果蔬。果蔬果实在不发生冷害的前提下，采用尽可能低的温度可以有效地控制果蔬果实在货架期内的呼吸强度，使某些容易腐烂的果实处于休眠状态；其次采取相对高湿的环境可有效降低果蔬水分蒸发而减少失重（刘忆冬等， 2005）。冷藏技术最大的局限性在于低温只能抑制病原菌，不能根除，而且一些热带、亚热带果蔬果实在低温下冷害情况严重（任红等， 2007） 。 由于低温贮藏、辐照处理和热处理等物理方法都需要特定的设备 ，这些方法在执行起来受到成本、产地、运输条件等限制。目前，在经济发达地区，低温贮藏链结合化学杀菌剂是比较成熟的商业采后处理技术。
