1、 绵阳师范学院 本科生毕业论文（设计） 题 目 蛇苔过氧化物酶 Cys127-gly 突变体与酵母表达载体的构建 专 业 生 物 技 术 院 部 生命科学与技术学院 学 号 0811420347 姓 名 指 导 教 师 答 辩 时 间 2012 年 5 月 论文工作时间： 2011 年 10 月 至 2012 年 5 月 蛇苔过氧化物酶 Cys127-gly 突 变体与酵母表达载体的构建 学 生：邱永秀 指导教师：边春象 摘 要： 本研究以过氧化物酶基因为原材料，构建其突变体，使氨基酸序列中的色氨酸转换为甘氨酸，酶蛋白 中失去二硫键。然后利用设计好的引物扩增突变体序列以及质粒 DNA，利用双酶
2、切法产生粘性末端，使突变体 DNA 与质粒 DNA连接产生重组体。再利用电穿孔转化法将重组质粒转入酵母细胞中进行表达。并挑选阳性菌株进行 PCR 和双酶切鉴定。 该试验通过过氧化物酶突变体的构建与表达，获得了含甘氨酸的过氧化物酶蛋白，为过氧化物酶的进一步研究奠定了基础。 关键词： 突变体；表达载体； PCR ；琼脂糖凝胶电泳；双酶切 Snake moss peroxidase Cys127-gly mutants and the construction of yeast expression vector Undergraduate: Qiu Yongxiu Supervisor:Bian
3、Chunxiang Abstract： In this study, Construct mutant by using peroxidase gene as raw material，making the tryptophan become to glycine in the conversion of amino acid sequence。Enzyme protein lost its disulfide。 Then use the designed primers to amplify mutant sequences， as well as plasmid DNA, Use the
4、double enzyme method to produce sticky end。 Then connect the mutant DNA and plasmid DNA to produce recombinant。 Then use Electroporation conversion method to Transplant recombinant plasmid into yeast cells to express。 And the select out the positive strains， using them to do the PCR and double restr
5、iction enzyme identification. The test by constructing and expressing the peroxidase mutant ， Obtaining the protein containing glycine peroxidase， laying the foundation for further study of peroxidase Key words: mutant； expression vector； PCR； Agarose Gel Electrophoresis ；Double Digests 目 录 1 前言 .1
6、1.1 蛇苔过氧化物酶的研究现状 .1 1.1.1 蛇苔的研 究现状 .1 1.1.2 过氧化物酶的研究现状 . 1 1.2 突变体的研究现状 .2 1.3 表达载体的研究现状 .2 1.4 实验目的 .3 1.5 实验意义 .3 2 实验材料 .3 2.1 实验样品 .3 2.2 实验培养基 .3 2.3 主要仪器及试剂 .5 2.4 主要试剂的配置 .5 3 实验方法 . 5 3.1 实验流程 .5 3.2 实验步骤 .6 3.2.1 突变体的构建 .6 3.2.2 突变体与质粒表达载体的扩增与纯化 .6 3.2.3 双酶切产生粘性末端 .7 3.2.4 目的基因与表达载体的连接 .7 3
7、.2.5 重组质粒的转化 . 7 3.2.6 重组子的筛选及鉴定 .9 4 结果及分析 .9 4.1 阳性菌株的生长状况 .9 4.2 突变体通过 PCR 扩增及纯化后产生的 DNA 序列的琼脂糖凝胶电泳图谱 .10 4.3 阳性菌株中提取的质粒经 PCR 扩增产生的 DNA 的琼脂糖凝胶电泳图谱 .10 4.4 阳性菌株中提取的质粒经双酶切产生 DNA 序列的琼脂糖凝胶电泳图谱 .11 5 讨论 .1 2 参考文献 .1 3 致谢 .15 1 前言 1.1 蛇苔过氧化物酶的研究现状 1.1.1 蛇苔的研究现状 2008 年，历经 30 年研究的中国苔藓植物研究项目喜获了国家自然科技进步二等奖
8、。国内外学者认为这将对苔藓综合性研究成果具有奠基性、开拓性和创新性，并且对生物医药等产业发展起到重要作用 13。苔藓植物是植物界中的一个重要门类 ， 属于低等植物，约占全世界植物总数的 5。从分类学角度可将苔 藓植物分为三类：角苔纲 (Hornworts)、苔纲 (Liverworts)、藓纲 (Mosses)。大约在 300 万年前，地球上就有了苔藓，比有花植物早了约 200 万年。苔藓分布很广，能适应多种气候环境，世界各处几乎都有分布，尤其多生于阴暗潮湿地区，如热带雨林和山林，特别是土坡、沟边或沼泽地等。苔藓植物虽然分布面积较广，但密度较小，种间杂生，不易区别和分离，难以大量采集，对其进行
9、化学成分的研究长期受到忽视，直到近 3O 年来，随着分析仪器精密性越来越好，分析技术不断进步，测定一个天然产物的结构所需要的量越来越少，苔藓 植物化学成分的研究才取得一定进展。研究结果表明，苔藓植物中具有许多新颖的结构骨架，含有不少生物活性成分。苔藓植物是具有潜力的天然产物的宝库 14。 蛇苔 （ Conocephalum conicum） 是 蛇苔科蛇苔属植物。植物体叶状，深绿色 ， 革质，具光泽，多回二歧分叉，表面可见六角形或菱形的气室，气孔单一型，位于气室中央。腹面中部具多数假根，两侧各有一列深紫色鳞片。雌雄异株。 雌托具长柄，并具一假根沟 ， 生于叶状体背面先端 ， 圆锥形，托下着生
10、58 个总苞，每苞内具一个孢蒴，孢蒴长梨形，具短柄。 蛇苔的生境 多 分布 于溪 边林下湿碎石和土上。分布于我国各省区 ， 以及俄罗斯远东地区、朝鲜、日本、欧洲和北美洲。 蛇苔 常用于解热、消肿止痛、用于治疗毒蛇咬伤、烧伤 烫伤 、无名肿痛等 15。 民间一直沿用蛇苔(Comocep-batum conicus(L.) Dun)捣碎外敷治毒蛇咬伤、烫伤。 1.1.2 过氧化物酶的研究现状 过氧化物酶 (Peroxidase， POD， EC 编号： 1.11.1.7)是一类从植物、动物、微生物中提取出来的氧化还原酶 ， 其以血红素为辅基，参与生物体内的生理代谢 1。在有机体的新陈代谢过程中，过
11、氧化物酶主要是催化分 解生物体内的氧化物或过氧化物氧化分解其它毒素 2。 过氧化物酶是广泛存在于各种动物、植物和微生物体内的一类氧化酶。催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应 ： RH2+H2O2 2H2O+R。 植物过氧化物酶的研究可追溯到 1809 年用愈创树脂为底物进行的颜色反应。但直到一个世纪之后才开展此酶的分离和命名。已知的催化反应底物超过 200 种 ， 以及多种过氧化物和辅助因子。迄今被研究最深入的应首推辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase， HRP)。早在 1940 年， Thorell 即用电泳方法从部分纯化 的辣根组织中区分出 2 种不同的 HR
12、P，之后此酶在植物正常和应激反应代谢中发挥重要作用而受到广泛关注 ， 并对此酶进行了大量研究 ， 涉及酶的种类、等电点、氨基酸组成和序列、生理功能，以及基因表达和调控的分子机制等。迄今此酶作为一种商品化试剂也广泛用于免疫组织化学、电镜技术、酶联反应和免疫印迹等生物学研究，并成为重要的诊断试剂 3。 POD 作为植物细胞内重要的组成成分，具有许多非常重要的生理功能。由于其成分和结构的复杂性，同功酶的多样性，以及多基因编码特点，造成对其功能的认识尚不全面。迄今已肯定的功能有： 参与活性 氧代谢，在活性氧代谢过程中， POD 发挥了重要作用。 参与木质素和木拴质的合成，木质素和木栓质的积累与 POD
13、 活性增强之间的关系已被许多试验所证实。 参与生长素的降解 ，由 POD 参与的吲哚乙酸的氧化分解功能早已被注意。 参与其它物质的氧化过程 ， 许多体外试验发现， POD 可参与催化谷胱甘肽、 NADH、 DTT、草酰乙酸、氢醌、酪氨酸、阿魏酸等酚类化合物的氧化 11， 12。 生理功能与环境胁迫的关系，除了与植物正常代谢和生长发育相关的结构型 POD 外，很大部分 POD 的合成属于诱导表达型 。 过氧化物酶可作为矮生品种的预 选标志 ， 植物的高度与过氧化物酶活性呈负相关，这与细胞中 IAA 被氧化、减慢生长速度有关，McCune(1959)进行豌豆生长实验时发现。其生长速度与过氧化物酶活
14、性呈反比。 1.2 突变体的研究现状 在遗传分析中，为了获得某一组分的功能，而将其敲除形成的个体叫做突变体。突变体往往具有与野生型不同的表型，这样就为缺失组分的功能提供了有益的信息。同样，现在会将含有某一组分过表达的个体也称为突变 体。 产生突变体的方法有物理和化学诱变、同源重组、基因沉默以及插入突变等。突变体库就是由某种方法产生的、包含各种不同基因突变的 群体。通过突变体确定基因的功能，有正向遗传学和反向遗传学两种策略。反向遗传学是从突变的基因序列出发，鉴定该基因突变产生的突变体，最终确定该基因的功能。正向遗传学是从突变的表型出发克隆到发生了突变的基因，确定该基因的功能。结构基因组学的研究为
15、反向遗传学研究提供了大量的待鉴定的基因序列，反向遗传学研究也成为功能基因组研究的一个重要手段。物理、化学诱变比较容易得到饱和突变体库，但突变基因的克隆要用较复杂的图位克隆法难以在获得全基因组测序信息的基础上进行基因功能的研究。同源重组的酵母和鼠类中用得比较成功的一种方法， 但植物中同源重组率比较低。基因沉默在线虫的突变体库构建中得到成功应用，但并不适合于植物。 1.3 表达载体的研究现状 表达载体（ Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、 RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的
16、大肠杆菌 表达载体。其基本骨架为来自 pBR322 和 pUC 的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合 tac 强启动子和终止子，在启动子下游有 RBS 位点（如果利用这个位点，要求与 ATG 之间间隔 5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端（多为黏性末端，也有平末端），采用 DNA 连接酶连接，导入生物体实现表达。标记基因可帮助识别质粒并检测是否成功整合到染色体 DNA 中。 1.4 试验目的 通过构建蛇苔过氧化物酶的突变体，利用双酶切使表达载体与突变体产生相同的粘性末端，将
17、二者连接，采用电击法将重组质粒导入酵母中进行表达。筛选出阳性菌株，因甘氨酸代替了色氨酸，产生不含二硫键的酶蛋白。并对质粒及突变序列进行鉴定。 1.5 试验意义 该试验通过过氧化物酶突变体的构建与表达，获得了含甘氨酸的过氧化物酶蛋白，为过氧化物酶的进一步研究奠定了基础。 2 试验材料 2.1 试验样品 蛇苔过氧化物酶基因序列 、酵母、质粒表达载体、引物 2.2 试验培养基及常用溶液 溶液名称 Reagents 溶液配方 Prescription LB 培养基（ 1L, pH 7.2） 胰化蛋白胨 10g， 酵母提取物 5g， NaCl 5g YEB 培养基（ pH 7.4） 牛肉浸膏 5g/L，
18、 酵母膏 1g/L， 蛋白胨5g/L， 蔗糖 5g/L， 硫酸镁 0.04g/L Buffer I 50mmol/L 葡 萄 糖 ，25mmol/LTris(pH8.0) ； 10mmol/L EDTA(pH8.0)， 高压灭菌 Buffer II 0.2M NaOH， 1%SDS， 现用现配 Buffer III 5 mmol/L 乙酸钾 60mL， 冰乙酸 11.5 mL， 水 28.5 mL YPD 培养基 TB Buffer 3.0g PIPES (10mmol/L) ， 2.2g CaCl2H2O (5mmol/L)， 18.6g KCl 定容100 mL 10mg/L 溴化乙锭 1
19、0mL 水中加入 0.1g 溴化乙锭，磁力搅拌器搅拌数小时以确保其完全溶解，然后室温保存于棕色瓶中。 SDS 电泳加样缓冲液 常用 1.6mL 浓缩胶缓冲贮液（ 1mol/L （ 0.08 mmol/L Tris.Cl， pH 6.8） Tris. Cl， pH 6.8； 4mL 10% SDS， 0.3g 二硫苏糖醇（或 1mL-巯基乙醇） ，2.5mL8甘油 ， 0.1mg 溴酚蓝；双蒸水稀释至 20（ 1）， 4 保存。 考马斯亮蓝 R-250 染色液 45mL 甲醇 ， 45mL H2O， 10mL 冰乙酸溶解 0.25g 考马斯亮蓝 R250 10 %过硫 酸铵（ 10mL） 1g
20、过硫酸铵定容 10mL 0.5 mol/L EDTA（ 1L pH8.0） 在 800mL 水中加入 186.1g 二水乙二胺四乙酸二钠 （ EDTA-Na2H2O） ， 在磁力搅拌器上剧烈搅拌 ， 用 NaOH 调节溶液的 pH 值至 8.0(约需 NaOH 颗粒 20g)然后定容至 1L 分装后高压灭菌 ， 备用 考马斯亮蓝 R-250 脱色液 乙醇 50mL，冰乙酸 100mL， ddH20 850mL，充分混合后使用 固定液 甲醇 250InL，乙酸 37.5mL， ddH20 212.5 mL，充分混合后使用 转移缓冲液 Trisl.93g，甘氨酸 9g，加 ddH20 定容至IL，
21、调节 pH 为 8.18.4。 TBS(Tris 盐缓冲液 ) 5mL 2mol/L Tris-HCl(pH7.5)， 37.5mL 4mol/L NaCl， 加 ddH2O 定容至 1L。 封闭液 (3% BSA/TBS) 称取 3gBSA，加 TBS定容至 100mL， 4保存。 30 丙稀酰胺溶液（ 100mL） 29g 丙稀酰胺与 1g N, N-亚甲双丙稀酰胺混和，去离子水定容至 100mL SDS 电泳脱色液（ 100mL） 45mL 甲醇 ， 45mL H2O， 10mL 冰乙酸 混和 10 SDS 溶液 （ 100mL） 10g SDS 定容至 100mL 分离胶缓冲液（ 10
22、0mL 1.5mol/L pH8.8） 18.171g Tris固体与 8.5mL 0.1mol/L HCl 混和加水定容至 100mL 续表 2-4 溶液名称 Reagents 溶液配方 Prescription 浓缩胶缓冲液（ 100mL 1.0mol/L pH6.8） 12.12gTis 固体加水定容 100mL 0.1 SDS 溶液（ 100mL） 0.1g SDS 固体定容 100mL SDS 电泳加样缓冲液 （ 0.08 mmol/L Tris.Cl， pH 6.8） 常用 1.6mL 浓缩胶缓冲贮液（ 1mol/L Tris. Cl， pH 6.8； 4mL 10% SDS， 0
23、.3g 二硫苏糖醇（或 1mL-巯基乙醇） ，2.5mL8甘油 ， 0.1mg 溴酚蓝；双蒸水稀释至 20（ 1）， 4 保存。 Tis-甘氨酸电泳缓冲液 900mL 水中溶解 15.1g Tis-碱和 94g 甘氨酸，然后加 50mL10% SDS定容至 1L。 2.3 主要仪器 仪器 型号 产地 梯度 PCR Themo-HybaidPx2 美国 旋涡混合器 Voreex-Genie2 美国 超低温冰箱 MDF-192 日本 超纯水系统 Milli-QBiocel 美国 迷你离心机 MINISPIN PLUS Germany 超声破碎仪 JY92-II 宁波科生仪器厂 恒温制冷和加热水浴
24、ChillMaster 德国 电穿孔系统 Gpxcell 美国 冷冻干燥仪 Vo802-oos 台湾 电子分析天平 BP211D 德国 超滤仪 MillPore Labscale TF 美国 生物大分子纯化系统 AKTA Explorer 美国 GE 公司 常规电泳系统 (一套 ) Mini-PROTEIN 3 Cell PowerPac HC 美国 BIO-RAD 紫外可见分光光度计 Uitrospec3300pro 美国 GE 公司 恒温培养培养箱 PYS-DHS 400-BS-2 上海康华生化仪器厂 冷冻离心机 5415DIR 德国 恒温水浴锅 HH-6 上海康华生化仪器厂 超净工作台
25、SB-JC-1A 上海康华生 化仪器厂 全自动高压灭菌锅 SANYO LA60 Autoclave 日本 荧光系统显微镜 Olympus BX51 日本 凝胶成像分析系统 UNIVERSAL HOOD II 美国 BIO-RAD 超纯水系统 Milli-QBiocel 美国 制冰机 Sim-F124 日本 3 试验方法 3.1 试验流程 方案设计 突变体的构建 突变体与质粒表达载体的扩增与纯化 双酶切 目的基因与表达载体的连接 电穿孔转化 重组子的筛选及鉴定 3.2 试验步骤 3.2.1 突变体的构建 3.2.2 突变体与 质粒表达载体的扩增与纯化 3.2.2.1Cys127Gly POD 编
26、码区序列的扩增 取 Cys127Gly POD 序列 作为模板，分别以 构建好的引物 进行 PCR 扩增。每一样品的 PCR 扩增体系均为 50L，其中包括： 引物 GYHWF Sense: CTTACGTACAGTTGAGGCCAGACTTTTACGAGC SnaB I GYHWR Antisense: AACCTAGGAGAGTTGGGCTTCCTGCAGTTG Avr II 59.9 配制反应体系在超净工作台上进行，反应设不含 DNA 模板的阴性对照，以防止外源 DNA 污染造成的错误。反应体系配制完成后进行瞬时离心，并以石蜡油封顶，然后放于 PCR 仪进行扩增。 PCR 扩增条件（常规
27、 PCR）： 94 30s 59.9 30s 72 1min 4 保存 3.2.2.2 质粒的 PCR 扩增（方法同上） 3.2.2.3 PCR扩增产物的检测及纯化 用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果， 并回收、纯化。 本实验使用 Omega公司生产的 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒进行回收，具体操作步骤 按 OmegaTaq DNA 聚合酶 0.25L(5U/L ) Buffer(l0PCR 缓冲液 ) 5L MgCl2 3L (25mmol/L) dNTP 4L(20mmol/L) 引物（ 10mol/L） 各 2L cDNA 模板 2L ddH2O 31.75L Total 50L 30 次
