1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 冷诱导分散液 -液微萃取用于牛奶中三聚氰胺的检测 所在学院 专业班级 环境工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 1 摘 要 本文结合对食品中有害物质的检测，建立了冷诱导分散液 -液微萃取牛奶中三聚氰胺的富集的新方法，以 四氯乙烯为萃取剂，同时结合高效液相色谱进行检测，在优化的萃取条件下，三聚氰胺的线性范围为 10 200 g/L。与传统的萃取方法相比，本方法具有操作简单、快速、准确、低成本、环境友好和富集倍数高等优点。 关键词： 液微萃取、三聚氰胺、快速、准确 2 COLD INDUCED SCATTERED LIQUID-LIQ
2、UID MICROEXTRACTION FOR MILK MELAMINE DETECTION ABSTRACT This paper established the cold induced dispersed a liquid microextraction, high performance liquid chromatography (HPLC) CIAME, fast and sensitive analysis milk melamine residue new method. The results show that compared with traditional extr
3、action method, this method is simple, rapid, accurate, low cost, environmental friendly and enrichment multiples higher yield. Keywords: Liquid microextraction, melamine, rapid and accurate 目录 摘 要 . I ABSTRACT . 2 1. 绪论 . 1 1.1 三聚氰胺检测的目的意义 . 1 2. 三聚氰胺研究 . 2 2.1 三聚氰胺 . 2 2.2 乳制品中三聚氰胺的检测方法 . 3 2.2.1 基
4、本原理 5 . 3 2.2.2 方法步骤与结果判定 . 3 2.2.3 离子交换色谱紫外检测法 9-11 . 3 2.2.4 液相色谱一质谱 /质谱测定 (LC MS/Ms)11 . 3 2.2.5 高效液相色谱法 (HPLC)测定乳品中三聚氰胺 12-13 . 3 2.3 相关研究的最新成果及动 态 14 . 4 3.分散液 -液微萃取 . 6 3.1 分散液液微萃取法 2223 . 6 3.2 色谱法 27 . 7 3.3 联用技术 . 7 3.3.1 DLLME-GC 联用 28 . 7 3.3.2 DLLME-HPLC 联用 29 . 8 4.实验部分 . 9 4.1 实验部分 . 9
5、 4.1.1 试剂与仪器 . 9 4.2.2 色谱条件的选择 . 10 4.2.3 萃取过程 . 11 4.2 结果与讨论 . 11 4.2.1 萃取剂种类和用量对萃取效果的影响 . 11 4.3.2 分散剂种类及用量对萃取效果的影响的影响 . 12 4.3.3 pH 对萃取效果的影响 . 13 4.3.4 温度对萃取效果的影响 . 14 4.3.5 盐浓度对萃取效果的影响 . 15 4.3 超声辅助冷诱导分散液 -液微萃取方法的性能评价 . 16 4.3.1 方法的线性范 围和检出限 . 16 5.总结 . 17 参考文献 . 18 1 1. 绪论 1.1 三聚氰胺检测的目的意义 2008年
6、 9月，国内爆发了三鹿问题奶粉事件，导致数百万名食用含三聚氰胺奶粉的婴幼儿患肾结石等病症住院治疗。国家质检总局在全国紧急开展婴幼儿奶粉三聚 氰胺含量专项检查。由于三聚氰胺的含氮量高达 66.63%，而目前测定牛奶中含蛋白质的含量是采用食品行业通行的 “凯氏定氮法 ”，即通过测定食品中氮原子的含量而间接推算的法，因此，三聚氰胺经常被不法生产者和销售商作为 “蛋白精 ”用来提升牛奶中所谓蛋白质含量的指标。三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料，白色无味结晶粉末。这种化学品常被用于生产塑料、胶水和阻燃剂，在部分亚洲国家，它也被用于制造化肥。不易被机体代谢，具有肾毒性与致癌作用。大量动物实验表明，长期
7、摄入三聚氰胺会造成 生殖泌尿系统的损害，膀胱，肾结石，尿毒症和慢 性肾衰竭，并可进一步诱发膀胱癌，对消费者造成了极大的危害。卫生部等五部门立即颁布了 “2008年第 25号乳制品及含乳食品中含三聚氰胺临时管理限量值规定 ”的公告，规定：婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为 1 mg/kg,液态奶（包括原料乳），奶粉及其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为 2.5 mg/kg。因此，建立快速的检测方法以确保食品的安全十分必要。目前乳制品中三聚氰胺的检测方法主要包括：试剂盒检测法，液相色谱法（ LC），液相色谱 质谱法（ LC-MS） ,气相色谱法（ GC-MS） 1。选用试剂盒检测法结果容易出现假 阳性
8、。 LC是目前最常用的测定方法，但由于三聚氰胺属于强极性化合物，其在普通的 C18色谱柱上几乎无保留，因此需添加庚烷磺酸钠或者辛烷磺酸钠对试剂以得到较好的保留。 GCMS和 LCMS均可作为三聚氰胺的确证方法，但 GC-MS需要衍生化，操作繁琐 ;由于 LCMS不能使用离子对试剂，因此只能使用一些特殊填料的色谱柱使三聚氰胺得到更好的保留。新颁布的农业部标准 NY T1372 2007建立了 HPLC法和 GCMS法。以上方法，存在过程冗长、需要衍生、试剂用量较大及灵敏度低等缺点。 近年来建立了多种新型样品前处理技术 2，如固相萃取、分子印迹技术、固相微萃取、悬滴液相微萃取、离子液体双水相。这些
9、方法需采用大量的有机溶剂 ,而有机溶剂本身又会对环境造成污染 ,因此开发具有有机溶剂用量少、富集效率高的样品处理方法 ,对于化学工业走科技含量高、资源和能源消耗低、环境污染小的发展道路具有一定的实际意义。 2 2. 三聚氰胺研究 2.1 三聚氰胺 图 2-1 三聚氰胺分子式 3 牛奶和奶粉添加三聚氰胺，主要是因为它能冒充蛋白质，并且是一种白色结晶粉末，没什么气味，掺杂后不易 发现。食品都是按规定检测蛋白质含量的。但商家为谋取暴利，给牛奶掺入大量的水，这样蛋白质含量就会降低 很多 。于是商家就利用了蛋白质监测方法上的漏洞，蒙混过关。三聚氰胺为纯白色无味的单斜棱晶体，水溶解度 为大约 0.35 g
10、/100 mL，相对密度 1.573 g/cm3(16 )；常压下 354 分解，快速加热至 300 升华，比热 1.473 kJ/(kg )；溶于热水，微溶于冷水，极易溶于热乙醇，不溶于乙醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、甘油、毗啶等；化学性质较稳定，受热或燃烧时分解生成含氰化物、氮氧化物和氨 等有毒和刺激性烟雾。水溶液呈弱碱性，能与各种酸反应生成三聚氰胺盐；遇强酸或强碱溶液水解；与醛类反应生成加成化合物；在微酸性 (pH值 在 5.56.5左右 )条件下与羟甲基衍生物缩聚生成树脂。它具有耐电弧、绝缘性好、防火耐热、易于着色等特性，而且有很高的稳定性，主要用于生产塑料、地板砖、厨房用
11、具、防火纤维、商业滤膜、胶水和阻燃剂等，也可用作合成药物的中间体 3。三聚氰胺不易被机体代谢，具有肾毒性与致癌作用。大量的动物实验表明，三聚氰胺具有肾毒性，长期摄入三聚氰胺，会造成生殖泌尿系统的损害，膀胱，肾结石，尿毒症和 慢性肾衰竭，并可进一步诱发膀胱癌协 。它能够随尿液 pH的变化形成不溶性复合物，从而对肾组织造成损伤。 后来据相关资料 4大鼠和狗服用大量三聚氰胺后会出现多尿现象；雌性大鼠 13周饲喂实验中，发现近端。肾小管有石灰质存积；经两年喂养实验，还发现有慢性肾脏炎症。国家卫生部于 2008年 9月 12日发布的 “与食用受污染三鹿牌婴幼儿配方奶粉相关的婴幼儿泌尿系统结石诊疗方案 ”
12、中指出，三聚氰胺导致的肾结石绝大部分累及双侧输尿管，这与成人泌尿系统结石临床表现有所不同，多发性结石影响肾功能的概率更高。 3 2.2 乳制品中三聚氰胺 的检测方法 2.2.1 基本原理 5 将已知抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定时把待检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，然后加入底物显色，进行定性或定量测定。 2.2.2 方法步骤与结果判定 将三聚氰胺 HRP酶标记物 6、标样及样品提取液加入包被三聚氰胺抗体的试验孔中培养 30min，将样品中提取的三聚氰胺与 HRP酶标记物竞争结合
13、三聚氰胺抗体 7。培养后除去孔内液体和未结合的三聚氰胺和 HRP酶标记物，每孔加入清澈的底物溶液，结合的酶标记物将无色的底物转化为蓝色。培养 30 min终止反应，用酶标仪读取 450 nm下各孔的 OD值，比较样品的 OD值与标样的 OD值，计算出样品中三聚氰胺浓度，最低可检测到 10 pg/kg以下的三聚氰胺残留。检测过程约需 65 min，该方法的优点是操作简单方便，一次可处理多个样品；其缺点是结果容易出现假阳性 8。 2.2.3 离子交换色谱紫外检测法 9-11 检测试样用水和乙腈提取，分析时用 LC SCX离子交换色谱柱分离，浓度为 0.05 mol/L磷酸二 氢钾 (pH值为 3.
14、0)乙腈 (70： 30)为流动相，流速为 1.0 mL/min，在紫外波长240 nln下检测。三聚氰胺在 0.5 100.0 mg/L的范围内，质量浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系 (r=0.9999)，最低检出限为 1.0 mg/kg，加标回收率在 93.8 102.5范围内，相对标准偏差小于 3.5，该方法简便、快速、准确，能够满足检测要求。 2.2.4 液相色谱一质谱 /质谱测定 (LC MS/Ms)11 试样用三氯乙酸溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱质谱 /质谱法检测和外标法定量。以 10 mmol/L乙酸铵溶液 -乙腈 (50： 50， pH=3.0)为流动相，
15、流速为 0.2 mL/min，采用正离子模式的电喷雾质谱检测，以一级质谱得到准分子离子m/z127作为母离子，进行碰撞诱导解离 (CID)二级质谱分析 (MS2)，选择母离子和 MS2的碎片离子 m/z85、 68定性确证，提取 m/z85、 68、 127三个离子质量色谱峰面积定量。本方法定量限为 0.01 mg/kg，在添加浓度 0.01 0.5 mg/kg浓度范围内，相对标准偏差小 。 2.2.5 高效液相色谱法 (HPLC)测 定乳品中三聚氰胺 12-13 高效液相色谱法在经典色谱法的基础上，用了气相色谱的理论。技术上，流动相改为高压输送，色谱柱以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而
16、使效果大大 的 高于经典液相色谱，同时柱后连有高灵敏度的检测器。用高效液相色谱可对出物进行连续检测，4 外标法定量。试样用三氯乙酸溶液一乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化，则以离子对试剂缓冲液 (柠檬酸、辛烷磺酸钠，调 pH为 3.0)， 乙腈 (90： 10)为流动相。流速为 1.0 mL/min，在波长 240 nm下测定。本方法定量限为 2mg/kg，在添加浓度 2 10 mg/kg浓度范围内，相对标准偏差小于 10。本方法简单、快速、经济，取样量小，对环境无污染，结果较准确，但操作条件对结果影响较大，只可以检出含量大于 200 mg/kg的样品。用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得
17、到的浓度为 0 8、 2、 20、 40、 80 mg/mL的标准工作液，浓度由低到高进样检测，得到标准曲线回归方程。气相色谱质谱联用法(GC-MS和 GC-MS-MS)试样经超声提取、固相萃取净化，氮气吹干，进行硅烷化衍生，衍生物采用选择离子监测质谱扫描模式 (SIM)或多反应监测质谱扫描模式 (MRM)，用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比定性，外标法定量。气相色谱质谱法 (GC MS)的定量限为 0.05 mg/kg，在添加浓度 0.05 2 mg/kg浓度范围内，相对标准偏差小于 10；气相色谱 -质谱 /质谱法 (GCMS/MS)的定量限为 0.005mg/kg，在添加浓度 0.00
18、5 l mg/kg浓度范围内，相对标准偏差小于 10，非常准确。 2.3相关研究的最新成果及动态 14 色谱分析法作为一种分离技术，是由俄国植物学家 Tswett在 1906年创立的，发展至今，已有将近百年的历史。色谱分析法原理是不 同物质在两相 (固定相和流动相 )中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次分配，从而使分配系数只有微小差别的组分得到分离。液相色谱法是以液体为流动相的色谱分析方法。迄今，液相色谱法已广泛应用于化工、医药、农业、环境监测等领域，在水质、大气、土壤、有机化工、食品、生物等方面已应用于实际指标分析。 液液萃取不仅耗时较长，而且处理时需要使用大量
19、挥发性有机溶剂，易造成环境的污染，且易形成乳化。固相萃取虽然可以解决液液萃取的一些问题，但它也需要花费大量时间、物力。固相微萃取装置的萃取头昂贵，使 用寿命较短，多次使用还存在交叉污染问题。膜萃取一般需要一个特殊设计的装置，且存在稳定性较差，痕量富集时耗时较长，适用底物的范围有限等缺点。同时，目前对禁用化学品残留的检测手段，主要依靠高效液相色谱、分子印迹、液相色谱 -质谱联用仪等。传统的分析检测方法很难与这些仪器实现自动化。 2006年 , Rezaee等 15首次报道了一种新型样品前处理技术 ,即分散液相微萃( dispersive liquid-iquid microextraction，
20、 DLLME)。首先在样品溶液中加入数十微升萃取剂和一定体积分散剂， 混合液经轻轻振荡后即形成一个水 /分散剂 /萃取剂的乳浊液体系，再经离心分层，用微量进样器取出萃取剂就直接进样分析。该方法集采样、萃取和浓缩于一体，避免了固相微萃取中可能存在的交叉污染的问题，是一种操作简单、快速、成本低、富集效率高且对环境友好的样品前处理新技术 1617 ，在化学分析领域具有广泛的应用前景。 5 冷诱导分散液 -液微萃取技术与高效液相色谱法联用技术已经用于检测牛奶中的氟甲喹和萘啶酸。利用 1200系列高效液相色谱仪 (美国 Agilent公司 )，反相 Extend-C18柱 (250 mm x 4.6 m
21、m， 5 m)，柱温： 35 ，进样量： 10 m，流动相： V甲醇 /V水 =50/50 (pH=4)；流速： l mL/min，检测波长： 310 nm。用注射器把 50.0 m OmimPF6和 0.75 mL乙腈的混合物迅速注入含有 50 m/L氟甲喹和 50 m/L萘啶酸的 10 mL水溶液中 (45 )，然后放在冰水浴中冷却 5 mm后形成了一种雾状的溶液，离心，移去上清液，用 100 uL甲醇溶解 ,然后进行高效液相分析。这种方法检出限低，重现性好。按照以上的方法检测牛奶中的三聚氰胺，样品中加入有机溶剂 振荡提取，取上清液过滤进行高效液相色谱 (HPLC)分析。对丙酮、乙腈、乙醇
22、和异丙醇的提取物分别在甲醇 -离子对试剂流动相体系和乙腈 -离子对试剂流动相体系中进行测定和比较。 其 结果显示选择合适的流动相，使用丙酮、乙醇或异丙醇为提取剂可以获得较好的提取效果。在甲醇 -离子对试剂流动相体系中，三聚氰胺的质量浓度在 1.0 100.0 mg/L范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系 (r=0.99998)，检出限为 0.1 mg/kg，采用丙酮为提取剂，加标回收率为 97 103，相对标准偏差 (RSD)小于 5 1920。 2008年 l0月 7月 ， 国家质检总局发布国家标准 GB/T223882008原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法，确定了高效液相色谱法、液相色谱 -
23、质谱、质谱法和气相色谱 -质谱联用法作为三聚氰胺的 3种测定方法。其中 HPLC法采用 l三氯乙酸溶液和乙腈进行提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，在流动相中添加离子对试剂改造成反相离子对色谱后进行测定。 但是 该方法使用固相萃取柱对样品进行净化，除去乳制品中的一些杂质成分操作步骤相对比较繁琐，前处理时间长。同年 的 10月 15日质检总局发布国家标准GB/T224002008原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法 21，该标准只针对原料奶和不含添加物的液态奶，采用乙腈作为样品的蛋白沉淀剂和三聚氰胺提取剂，强阳离子交换色谱柱进行液相色谱分离测定。该方法前处理快速简便，只在 1个具塞试管中完成全部前处理程序，减少了中间环节的损耗，提高了样品回收率。但采用乙腈作为提取剂，增加了对检验人员健康危害和环境污染的风险，而且该方法需要配置强阳离子交换色谱柱。 再 本文 中将 结合以上 2个液相色谱检测方法用有机溶剂丙酮、乙腈、乙醇或异丙醇等对三聚氰胺进行提取，在反相离子对色谱上分析。在实验过程中筛选多 种有机溶剂作为液态奶中三聚氰胺的提取剂，减少对乙腈的消耗。三聚氰胺微溶于甲醇，而在二甲基亚砜中的溶解度较大，蔡勤仁等在提取溶剂中加入 10二甲基亚砜来提高提取回收率。
