油桐粕蛋白降解菌的筛选鉴定及固态发酵研究.DOC

1、油桐粕蛋白降解菌的筛选鉴定及固态发酵研究赵梦瑞 1 方勤敏 1 黎继烈 1 李培旺 2 张梦君 1 肖志红 2 李昌珠 2 吴红 2 谈泰猛 1 彭映晖 1（经济林培育与保护教育部重点实验室；中南林业科技大学 1，长沙 410004）（湖南省林业科学院 2，长沙 410004）摘 要 从自然发酵的油桐粕堆肥中分离到 1 株高效降解油桐粕蛋白的菌株并命名为 LYT-1。通过形态学观察、生理生化特征鉴定和 16S rRNA 序列分析确定该菌株系统发育地位，研究了接种量、温度、初始含水量和时间对该菌株固态发酵油桐粕的影响，并对发酵前后的游离氨基酸组成进行测定。结果表明：菌株 LYT-1 为枯草芽孢杆

2、菌 (Bacillus subtilis)；其最佳发酵条件为接种量 30%、初始含水量 60%、发酵温度 45 、发酵时间 7 d。在此最佳发酵条件下油桐粕中氨基态氮含量为 40.6 mg/g，较发酵前提高了 24.6 倍，游离氨基酸总量增加了 24.5 倍。因此，利用枯草芽孢杆菌发酵能够有效改善油桐粕蛋白的营养结构，提高其应用价值。关键词 油桐粕蛋白 筛选 鉴定 枯草芽孢杆菌 固态发酵 氨基酸 中图分类号：Q939.96 文献标识码： A 文章编号： 1003-0174（ ） - - Screening, Identification and Study of Solid Fermentat

3、ion of the strains degrading Tung Cake Protein Zhao Mengrui1 Fang Qinmin1 Li Jilie1 Li Peiwang2 Zhang Mengjun1 Xiao Zhihong2Li Changzhu2 Wu Hong2 Tan Taimeng1 Peng Yinghui1(Key Lab of Non-wood Forests Cultivation and Protection Co-constructed by China Education Ministry and Hunan Province; Central S

4、outh University of Forestry and Technology1, Changsha 410004)(Hunan Academy of Forestry2, Changsha 410004)Abstrect A bacterial strain efficiently degrading the Tung cake protein was isolated from the aggregated fermented Tung cake and named LYT-1. The strain was identified on the basis of morphologi

5、cal characteristics, physiological and biochemical testing and the 16S rRNA gene sequence analysis. The effects of inoculation amount, temperature, initial moisture content and time on solid fermentation of Tung cake were studied. Moreover, the free amino acid composition of Tung meal was analyzed b

6、efore and after fermentation. The results showed that the stain of LYT-1 was Bacillus subtilis. The optimum fermentation condition was 30% inoculation amount, initial moisture content 60%, fermentation temperature 45 and 7 d for fermentation time. Under the above conditions, the content of ammonia n

7、itrogen in the Tung cake increased to 40.6 mg/g with 24.6 times higher than that before fermentation, and the total amino acid increased by 24.5 times. Therefore, fermentation with Bacillus subtilis can effectively improve the nutrition structure and application value of Tung cake protein.Keywords T

8、ung cake protein，screening，identification，Bacillus subtilis，solid fermentation, amino acid油桐是我国本土木本油料树种，历史悠久。油桐具有生长快，产量高，适应性广，种子含油率高且营养丰富等优点 1-2。桐籽榨油后的主要副产物桐粕，含有蛋白质36.3% 45%(浸基金项目：湖南省科技重大专项(2016NK1001)；湖南省重大专项(2016NK1001-4)；湖南省科技计划(2015NK2020)作者简介：赵梦瑞，女，1992 年出生，硕士，生物资源学通讯作者：黎继烈，女，1959 年出生，教授，博士生导师，

9、农产品加工出法)，是一种优良的植物蛋白资源， 还有丰富的大量元素如 P2O5 1.8%2.7%，K 2O 1.2%1.3% ，以及多种微量元素 3。黄诚 4研究发现油桐粕中有皂角甙和佛波醇及其相关化学物质等两种毒素，因此其饲用受到限制，长久以来多作为饼肥还田使用。油桐粕作农用肥肥效高且持久，有助于改良土壤的理化性质，能够在一定程度上规避对于化学肥料的依赖。但是经传统堆肥后施用，饼粕中大分子蛋白质降解时间长，存在着饼肥不符合植株生长相应的氮素供需规律、蛋白质等营养物质利用率低的问题 5-6。相对于已有的一些改善大分子蛋白质营养结构的化学法和物理法，微生物发酵法具有消耗少，产率高，易操作和大规模生

10、产等优势，成为目前解决这个问题一种有效方法。而微生物发酵的关键在于优势菌种的选育。但是目前关于油桐粕肥源化的研究和成果还比较少。方亭亭等 7研究桐籽饼粕蛋白降解菌，筛选到三株对桐籽饼粕粗蛋白均表现出较强降解能力的白色短小杆菌B.licheniformis、地衣芽孢杆菌 B.licheniformis 和肉葡萄球菌 C.albidum，但是并未对三株细菌进行深入探究。本研究从自然发酵的油桐粕堆肥中，分离筛选能够耐受桐粕毒素并高效降解油桐粕蛋白的菌株，从形态学、生理生化和分子生物学水平，分析确定该菌株系统发育地位，研究其固态发酵油桐粕的最佳工艺参数，为提高油桐粕蛋白的营养和应用价值，以及油桐粕的肥

11、源化再利用研究提供参考。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品供试油桐饼粕为湖南国盛生物能源股份有限公司所提供，测得该饼粕中蛋白质含量为28.6%，含油率为 7.2%，含水率为 6.3%。1.1.2 培养基NA 培养基 8用于细菌的分离培养；油桐粕浸出汁培养基：油桐粕 200 g，6090 下浸泡 34 h，用 8 层纱布过滤除去残渣获得桐粕汁，定容至 1 000 mL，pH 自然，121灭菌 20 min，用于菌株的初筛；油桐饼粕发酵底料：油桐饼粕和水按质量比等比例混匀， 500 mL 锥形瓶装量 40 g，121 灭菌 20 min，灭菌 2 次，用于菌株的复筛。 1.2 主要试剂与仪

12、器细菌 DNA 提取试剂盒、DNA maker、dNTP、DNA 聚合酶等：宝生物工程(大连) 有限公司；其余试剂均为国产分析纯。超净工作台：天津市泰斯特仪器有限公司；PCR 仪、凝胶成像仪：美国 ABI 公司；电泳仪：北京六一仪器厂；恒温摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；K06C 全自动凯氏定氮仪：上海晟声自动化分析仪器有限公司；DIONEX P680高效液相色谱：美国戴安公司。1.3 试验方法1.3.1 评估指标及其测定方法粗蛋白百分含量和总蛋白氮含量的测定采用凯氏定氮法 9：粗蛋白含量= 蛋白氮含量6.25。氨基态氮的测定采用甲醛法 10-11：精确称取油桐饼粕 5 g 于 250 m

13、L 烧杯中，加入 40 mL 蒸馏水。电炉加热煮沸 23 min。冷却至室温，上清液转移定容至 50 mL 容量瓶，吸取 10 mL 上清液，使用 pH 计调至 8.20 后加入甲醛溶液 10 mL，用 0.5 mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至 9.20 为终点，记下消耗氢氧化钠体积并计算氨基态氮含量。同时做试剂空白实验，计算方法如下： 104V.N-10）（Y基金项目：湖南省科技重大专项(2016NK1001)；湖南省重大专项(2016NK1001-4)；湖南省科技计划(2015NK2020)；湖南省重点研发计划（2017WK2021）收稿日期：2017-10-20作者简介：赵梦瑞，女，1

14、992 年出生，硕士，生物资源学通讯作者：方勤敏，男，1959 年出生，教授，博士生导师，农产品加工式中：Y氨基态氮含量(以氮计)/mg/g；V0样品加入甲醛后用去氢氧化钠标准溶液数 /mL；V试剂空白加入甲醛后好用氢氧化钠标准溶液数 /mL；Vl吸取稀释液数/mL； NNaOH 标准溶液的浓度 /(mol/L)；0.014消耗 1 mL NaOH 标准溶液相当氮的毫克当量 /g。1.3.2 菌株的筛选1.3.2.1 菌株的分离与初筛取 10 g 自然堆积发酵的油桐饼粕接种到装有 90 mL 无菌水的 250 mL 锥形瓶中，在 30 、180 r/min 下摇床培养 24 h，然后吸取 1

15、mL 悬浮液，用无菌水进行系列梯度稀释。分别吸取 100 L 稀释悬浮液（10 -810 -10）涂布至 NA 平板上，每个浓度重复 3 次。将平板置于 30 恒温培养箱中倒置培养 36 h，然后挑选形态各异的菌落进行划线纯化处理，并对其进行编号，保存于 4 下备用。将分离得到的菌株分别接种至装有 50 mL NA 液体培养基的 250 mL 锥形瓶中，30 、180 r/min 下恒温摇床培养 24 h，用无菌水调整菌液浓度至 108 CFU/mL12-13，吸取 5 mL 菌液接种到装有 50 mL 油桐粕浸出汁培养基的 250 mL 锥形瓶中，30 、180 r/min 下恒温摇床培养

16、72 h，然后吸取 1 mL 悬浮液，用无菌水进行系列梯度稀释。分别吸取 100 L 稀释悬浮液涂布至 NA 平板上，每个浓度重复 3 次。将平板置于 30 恒温培养箱中倒置培养36 h，采用稀释平板法对候选菌株进行计数 14，选择生长状况较好的菌株，保存于 4 下备用。1.3.2.2 菌株的复筛将初筛得到的候选菌株分别接种至装有 50 mL NA 液体培养基的 250 mL 锥形瓶中，30 、180 r/min 下恒温摇床培养 24 h，用无菌水调整菌液浓度至 108 CFU/mL12-13，按40%（V/m ）的接种量接种菌液至油桐粕发酵底料中，在 30 恒温培养箱培养 4 d，每隔24

17、h 进行翻样，每个菌株 3 组重复。发酵结束后，取出发酵物并在 70 下进行烘干处理，测定发酵前后样品中氨基态氮含量和蛋白质水解度，对比实验结果筛选出发酵效果比较好的菌株，进行后续的实验研究。1.3.3 候选菌株的鉴定形态学观察：将筛选得到的菌株划线接种至 NA 培养基上， 30 条件下培养 24 h，观察菌落生长形态，并进行常规的革兰氏染色。生理生化鉴定：参照常见细菌系统鉴定手册进行菌株生理生化特征鉴定。16S rRNA 基因序列分析：利用细菌 DNA 提取试剂盒提取候选菌株 DNA，采用细菌扩增通用引物 1516SF 和 16SR 扩增细菌的 16S rRNA；PCR 反应体系(50 L)

18、为 10PCR buffer 5 L，DNA 模板 1 L，dNTP(2.5 mmol/L)4 L，MgCl 2(25 mmol/L)3 L，引物(1 mmol/L)各 1 L，Taq DNA 聚合酶 0.5 L，加 ddH2O 至 50 L；反应条件为 94 5 min，94 30 s，53 30 s， 72 1 min，共 35 个循环，4 保存。扩增产物由上海生工生物工程有限公司进行测序，将测定的序列在 GenBank 中进行 BLAST 相似性比对，最后用 MEGA 6.0 的 Neighbor-Joining 构建系统发育树，确定候选菌株的系统发育学地位。1.3.4 候选菌株固态发酵

19、优化1.3.4.1 种子液培养将候选菌株接种至 NA 液体培养基中，30 、180 r/min 下恒温摇床培养 24 h，作为发酵种子液备用。1.3.4.2 接种量选择对接种量（5%、10%、20% 、30% 、40%、50%）进行单因素实验，发酵培养基中 50%初始含水率，初始 pH 自然，温度为 35 ，时间 4 d，每隔 24 h 进行翻样，每个处理重复 3次。发酵优化效果的评价以底物中氨基态氮含量为指标，测定方法同 1.3.2。1.3.4.3 发酵温度选择对温度（25、30、35、40、45、50 ）进行单因素实验，选择最优接种量，其他条件与处理同 1.3.4.2。1.3.4.4 初始

20、含水量选择对初始含水量（40%、45%、50%、55% 、60%、65%、70%）进行单因素实验，选择最优温度和接种量，其他条件与处理同 1.3.4.2。1.3.4.5 发酵时间选择对发酵时间（2、3、4、5、6、7、8 d）进行单因素实验，选择最优接种量、初始含水量和温度，其他条件与处理同 1.3.4.2。1.3.5 发酵前后游离氨基酸成分及含量检测采用高效液相色谱法对油桐饼粕及其在最优发酵条件下的发酵产物进行游离氨基酸组成和含量的测定，参照刘跃芹等 16建立的测定方法和 GB5009.124-2016，并对产物中氨基酸的变化进行分析。 2 结果与分析2.1 菌株分离与筛选2.1.1 菌株的

21、初筛通过稀释平板涂布法从堆积发酵的油桐饼粕中分离到 12 株细菌；初筛结果见表 1，有7 株细菌在培养 72 h 后的生物量较高，分别为 LYT-1、LYT-2、LYT-3、LYT-4 、LYT-5、LYT-8 和 LYT-9，其中，菌株 LYT-1 的生物量最高， 达到(2.67 0.22)107 CFU/mL，这可能与细菌自身的生长和代谢水平受桐粕浸出汁中营养成分和有毒物质的影响有关。因此，选取初筛得到的 7 株细菌进行进一步的发酵复筛。表 1 分离菌株的生物量差异情况菌株编号 生物量/CFU/mL 菌株编号 生物量/CFU/mLLYT-1 (2.67 0.22)107 LYT-7 (2.

22、02 0.22)103LYT-2 (2.74 0.22)106 LYT-8 (2.62 0.22)106LYT-3 (2.58 0.22)106 LYT-9 (2.00 0.67)107LYT-4 (2.00 0.67)107 LYT-10 (2.17 0.67)104LYT-5 (2.33 0.22)107 LYT-11 (2.33 0.22)103LYT-6 (2.33 0.22)105 LYT-12 (2.83 0.22)1042.1.2 菌株的复筛对初筛得到的菌株进行发酵复筛，桐粕中氨基态氮含量变化如图 1 所示，在相同的发酵条件下，7 株菌株发酵后底物中氨基态氮含量均有提高，其中 L

23、YT-1 菌株发酵效果最好，氨基态氮含量达到 19.3 mg/g，增长了 11.1 倍，因此选取发酵效果较好的 LYT-1 菌株进行下一步的研究工作。图 1 油桐饼粕发酵前后的氨基态氮含量2.2 候选菌株的鉴定2.2.1 形态学特征LYT-1 菌株在 NA 平板上 30 培养 24 h，菌落形态见图 2(A)，呈污白色，圆形和椭圆，表面粗糙、有突起，且不透明，菌落直径约(5.5 0.5) mm；革兰氏染色呈阳性，见图2(B)，为革兰氏阳性菌；芽孢染色显示有芽孢生成，见图 2(C)。图 2 菌株 LYT-1 的形态学特征：菌落形态(A)；革兰氏染色图 (B)；芽孢染色(C)2.2.2 生理生化特

24、征LYT-1 菌株的部分生理生化特征测定结果如表 2 所示，该菌株能够降解无机磷和纤维素，明胶液化和硝酸盐还原反应结果呈阳性，但对产氨试验和产吲哚实验的结果均为阴性。表 2 生理生化特征表性特征 反应特征 表性特征 反应特征触媒测定 + VP 实验 +氧化酶测定 - 纤维素分解 +柠檬酸盐利用 - 明胶液化 +卵磷脂酶活性 + 硝酸盐还原 -淀粉水解 + 产硫化氢 -丙二酸盐利用 - 解磷试验 +甲基红 MR + 产吲哚实验 -产氨试验 -注：“+” 代表反应为阳性， “”代表反应为阴性。2.2.3 16S rRNA 基因分子鉴定经 DNA 提取，PCR 扩增和测序获得的 16S rRNA 基

25、因的片段大小为 1327 bp。在GenBank 上进行 BLAST 比对，结果显示菌株 LYT-1 与枯草芽孢杆菌序列相似性达到 99%。从 GenBank 中分别调取芽孢杆菌属不同种的 11 株标准菌株的 16S rRNA 基因序列，构建系统发育树(图 3)，菌株 LYT-1 与枯草芽孢杆菌的亲源关系最近，提交序列后获得登录号为 KY626046。结合形态学、生理生化特征鉴定和 16S rRNA 序列分析结果，确定菌株LYT-1 为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 。图 3 基于 16S rRNA 基因序列相似性构建的菌株 LYT-1 的系统发育树2.3 菌株固态发酵条件

26、的优化2.3.1 最佳接种量和发酵温度的确定由图 4 可知，当接种量在 30%时，油桐粕发酵后氨基态氮含量最高，达到 30.0 mg/g；在接种量 30%条件下，当发酵温度为 45 时，油桐粕发酵后氨基态氮含量最高，达到33.7 mg/g。因此初步确定最佳接种量和发酵温度分别为 30%和 45 。图 4 最佳发酵温度和接种量的确定2.3.2 最佳初始含水量和发酵时间的确定由图 5 可知，在接种量 30%、发酵温度 45 条件下，初始含水量为 60%时，油桐粕发酵后氨基态氮含量最高，达到 36.3 mg/g；在接种量 30%、发酵温度 45 、初始含水量60%条件下，发酵时间为 7 d 时，油桐

27、粕发酵产物中氨基态氮含量最高，达到 40.6 mg/g，对比发酵前具有显著提高。图 5 最佳初始含水量和发酵时间的确定2.4 油桐粕发酵前与其发酵产物中的游离氨基酸分析样品中检测到 17 种氨基酸组份见表 3，由检测结果可知，固态发酵优化后游离氨基酸总含量显著增加，相比发酵前提高了 24.5 倍。各种氨基酸的含量也均有增加，其中谷氨酸、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的含量增幅较大。表 3 游离氨基酸的组成及含量氨基酸名称 发酵前含量/g/100g 发酵产物中含量/g/100g天门冬氨酸 0.012 0.046谷 氨 酸 0.008 0.29丝 氨 酸 0.009 0.014组 氨

28、酸 0.001 0.015甘 氨 酸 0.002 0.051苏 氨 酸 0.001 0.018精 氨 酸 0.007 0.015丙 氨 酸 0.003 0.062酪 氨 酸 0.001 0.13胱 氨 酸 0.001 0.003缬 氨 酸 0.002 0.24蛋 氨 酸 0.002 0.03苯 丙 氨 酸 0.002 0.15异 亮 氨 酸 0.001 0.29亮 氨 酸 0.002 0.17赖 氨 酸 0.001 0.027脯 氨 酸 0.008 0.06总氨基酸 0.063 1.613 讨论绿色有机肥是未来生态农业持续发展的重要方向。高氮、磷、钾含量的油桐粕是一种可开发利用的优良植物肥料基

29、质。本研究从自然发酵的油桐粕堆肥中筛选得到 1 株降解油桐粕蛋白效果较好的的枯草芽孢杆菌 LYT-1，探究了初始含水量、接种量、发酵温度和时间对该菌株发酵效果的影响，发现不同发酵条件下发酵效果具有差异性。通过对发酵条件进行优化，结果显示优化后桐粕发酵产物中氨基态氮含量显著提高。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一类革兰氏阳性杆状好氧型细菌，可以产生内生芽孢，其适应能力强，应用性广，没有致病性，对环境和人畜无害，是我国农业部批准使用的一种允许使用且可以直接饲喂动物的益生菌 17。枯草芽孢杆菌可产生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等多种消化酶，在形成芽孢过程中可分泌多种抗生素，因此，枯草芽

30、孢杆菌是一种理想的生物有机肥发酵菌种。由于枯草芽孢杆菌自身的优良特性，近年来引起了人们的广泛关注。本研究筛选到的枯草芽孢杆菌 LYT-1，能够有效降解油桐粕中大分子蛋白质为易被植物吸收利用的氨基酸和小肽类物质的同时还具有解磷和降解纤维素的能力。将其用于生物有机肥的制备，既能降解饼粕中纤维素从而提高还原糖含量，又可以帮助分解土壤中的无机磷以促进作物的生长，从而提高桐粕肥的营养价值。因此，枯草芽孢杆菌 LYT-1 在油桐粕肥及其它生物肥的发酵生产中都有很好的开发和应用前景。该菌株的其他特性以及在生产上的应用效果有待进一步的研究。4 结论4.1 以自然发酵的油桐粕堆肥为菌种来源，通过稀释平板涂布法和

31、划线分离法筛选到 1 株高效降解油桐粕蛋白的细菌 LYT-1。通过进行形态学、生理生化和 16S rRNA 序列分析，初步鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 。4.2 对该菌株固态发酵油桐粕的培养条件进行优化，以氨基态氮含量为评价指标，得到最佳条件为：接种量 30%、初始含水量 60%、发酵温度 45 C、发酵时间 7 d。在此发酵条件下，氨基态氮含量达到 40.6 mg/g，是优化前氨基态氮含量的 2.1 倍，比发酵前提高了 24.6倍。4.3 检测发酵优化前后油桐粕中游离氨基酸成分和含量，发现优化后游离氨基酸总量显著增加，较之前提高了 24.5 倍，表明用枯草芽

32、孢杆菌 LYT-1 发酵能够有效地降解油桐粕蛋白并改善其营养结构。参考文献1 张玲玲, 彭俊华. 油桐资源价值及其开发利用前景J. 经济林研究, 2011, 26(6): 130-136ZHANG Lingling, PENG Junhua. Values, development and utilization prospect of Vernicia fordii resourcesJ. Nonwood Forest Research, 2011, 26(6): 130-136 2 覃晓风, 蒋桂雄, 覃方友, 等. 我国油桐产业化发展战略调查研究报告 J. 经济林科学, 2011, 29

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