1、江苏省 2012 年柯萨奇病毒 A 组 16 型基因特征分析单 军，嵇 红，包 林，付建光，王慎骄，汤奋扬，周明浩，朱叶飞 *（江苏省疾病预防控制中心急性传染病防制所，江苏 南京 21009）摘 要 目的: 了解江苏省 2012 年柯萨奇病毒 A 组 16 型(CA16)分离株 VP1区基因特征。方法: 选取江苏省 2012 年 14 株 CA16 病毒分离株, 用 1 对特异性引物进行 VP1 区核苷酸序列扩增，对扩增产物进行测序，利用生物信息学软件对序列进行分析，结果与 CA16 参考株序列进行同源性比较并构建基因进化树。结果: 14 株 CA16 分离株 VP1 区核苷酸和氨基酸同源性分
2、别为 90.5%100%和98.7%100%，与国际 CA16 标准株 G10 的核苷酸和氨基酸同源性分别为75.5%76.7%和 91.6%92.3%。江苏省 2012 年的 CA16 分离株全部属于 B1 基因亚型，同时包含 B1a 和 B1b 两条进化分支。结论: 江苏省 2012 年有 CA16病毒的 B1a 与 B1b 两种进化分支共同存在与循环，且呈现以 B1b 基因亚型为优势型别、B1a 基因亚型为辅助型别的传播模式；无论是优势型别还是辅助型别，均各自呈现密切的亲缘关系。关键词 手足口病；柯萨奇病毒 A 组 16 型；VP1 基因；基因型中图分类号 R373.2 文献标识码 A
3、Analysis on genetic character of Coxsackievirus A16 strainsisolated in Jiangsu Province in 2012SHAN Jun, GI Hong, BAO Lin, FU Jian-guang, WANG Shen-jiao, TANG Fen-yang,ZHOU Ming-hao, ZHU Ye-fei*(Department of Acute Infectious Disease Control and Prevention , Jiangsu Provincial Center for Disease Pre
4、vention and Control, Nanjing 210009, China）Abstract Objective: To analyze the genetic characteristic of Coxsackievirus A16 (CA16) strains isolated from Jiangsu Province in 2012. Methods: 14 CA16 strains isolated from the samples of hand-foot-mouth disease (HFMD)patients were selected to conduct VP1
5、gene amplification using specific primers, and then sequenced.The homology and phylogenetic analyses were conducted between the 14 isolates and other CA16 strains downloaded from Genbank, based on the sequence of VP1 gene. Results: The sequence analysis showed that the homogeneity of the nucleotide
6、and amino acid of VP1 gene were 90.5%100% and 98.7%100%, respectively among 14 isolated CA16 strains.The nucleotide and amino acid homologies of VP1 gene were 75.5%76.7% and 91.6%92.3%, respectively among the prototype ( G10) and Jiangsu CA16 strains. All of the 14 CA16 isolated strains fell within
7、genogroup B and they were divided into 2 branches:B1a and B1b. Conclusions: The transmission mode was showed to be one dominant subgenotype of B1b and one secondary subgenotype of B1a co-circulated together. Both two subgenotypes showed close phylogenetic relationship in their own subgenotype respec
8、tively.Key Words Hand-foot-mouth disease; Coxackievirus A16; VP1 gene; Genotype基金项目 江苏省临床医学中心（高技术平台）(ZX201109) *通讯作者，E-mail：；单军和嵇红为并列一作手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD)是一种常见的传染性强、传播途径复杂、在短时间内可引起大规模流行的感染性疾病，其主要病原体是肠道病毒71型 (Enterovirus 71，EV71）和柯萨奇病毒A 组16型（Coxsackievirus A16，CA16）。由于EV71感染儿童后引起的手足口病可
9、伴有严重的并发症和后遗症，对生命健康造成严重威胁，因此一直受到人们的广泛关注。CA16是引起手足口病的第二大病原体，以往的研究认为CA16 引起的手足口病症状较轻，且较少引起严重的并发症 1，因此对CA16的研究相对较少。但近几年的研究发现，CA16感染可能与心肌炎、难治性休克等致死性并发症的发生有关 2，个别地区还有引起成人致死性肺炎的报道 3。江苏省2010-2012年的手足口病病原监测数据表明：CA16在重症病例中所占的比例呈逐年上升的趋势， 2012年手足口病病原构成中CA16所占比例已经高于EV71。基于此， 本研究对2012年江苏省手足口病病例分离的CA16毒株VP1区的基因特征进
10、行分析，旨在了解江苏省CA16 流行株与国内其他地区及其他国家分离株的遗传进化及分子流行病学关系。1 材料与方法1.1 材料 咽、肛拭子标本来自于2012年江苏省各地市疾病预防控制中心和哨点医院的手足口病患儿。1.2 方法1.2.1 病毒分离 按照手足口病预防控制指南（2009版） 4中病毒分离操作规程进行：标本接种于RD细胞，置于37，5%CO 2条件中培养，每天观察细胞病变（CPE） ，当CPE达到90%时收获上清液。1.2.2 病毒RNA的提取 采用QIAamp Viral RNA mini kit (QIAGEN公司，Cat.No:52904) 提取分离病毒的RNA ，按照说明书进行操
11、作。1.2.3 病毒分离物的鉴定 采用柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型+肠道病毒通用型核酸检测试剂盒（2+1）（荧光定量PCR法）（硕世公司，货号： JC20302）检测肠道病毒、EV71和 CA16。具体操作按照说明书进行，实验设置阴性和阳性对照，通过 Ct值和扩增曲线判读结果。1.2.4 VP1区域核苷酸序列的扩增 根据GeneBank 中收录的VP1基因序列，自行设计如下引物：CA16-VP1-F：5-AGGTACTACACCCAGTGGTCAG-3；CA16-VP1-R：5-GCAAGGTGCCGATTCACTACCCT-3。分离的病毒经鉴定是 CA16者，采用OneStep RT-
12、PCR Kit(QIAGEN公司，Cat.No：210212) 进行RT-PCR扩增，PCR条件为：50 30min逆转录；95 15min；然后95 30s，52 45s ，72 90s，35 个循环；最后72延伸10min。扩增产物进行 1.0%琼脂糖凝胶电泳。1.2.5 VP1区域的序列测定和分析 含目的基因片段的PCR产物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行双向测序。结果用DNA Star和MEGA5.2等软件进行分析，并对VP1区的核苷酸序列及氨基酸序列进行同源性比较和基因进化树的构建。2 结 果2.1 病毒分离与鉴定结果 2012年江苏省各地市送检的手足口病例标本经病毒分离后进行荧光定
13、量PCR鉴定，18株分离株CA16阳性。2.2 VP1区的RT-PCR结果 对18株CA16分离株进行RT-PCR扩增，电泳结果显示14株有约1400bp大小的含VP1区域的目的条带。2.3 VP1区核苷酸和氨基酸序列同源性分析 14株CA16分离株VP1 区全部测序成功。从 GeneBank中检索到CA16各型参考株VP1序列以及部分中国大陆CA16分离株VP1 序列共23株。将本次测序的14株CA16 分离株VP1 序列与上述序列进行核苷酸和氨基酸的同源性比较分析后发现：14株江苏分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为90.5%100%和98.7%100% ，其中10株分离株的氨基酸序列完全一
14、致。14株江苏分离株与G-10国际标准株（CAU05876）的核苷酸和氨基酸同源性较低，分别为75.5%76.7%和91.6%92.3%；与安徽阜阳株 FY18（EU812514）的核苷酸和氨基酸同源性也较低，分别为75.0%76.3% 和90.2%90.9% ；与其余 21株CA16参考株的核苷酸和氨基酸同源性分别为89.7%98.9% 和99.0%100% 。见表 1。2.4 基于VP1区的CA16 系统进化分析 利用MEGA5.2软件对14株CA16江苏分离株和GenBank中的23株CA16 及1株EV71国际标准株进行系统进化分析，方法为Neighbor-Joining。结果显示：1
15、4株江苏分离株在进化树中分别归属于两支，其中12株与Macheng0117-HuB-CHN-2011(JX975802.1)、JB14080521(HM776271)、MAS02-AH-CHN-2010(JQ409498)、Ningbo.CHN-044-2010(JQ315101)以及SZ-HK08-7(GQ279371)等中国内地分离株构成亲缘关系较近的一支，同属于B1b亚型；其余2株无锡分离株CA16/WUXI-1/2012 和CA16/WUXI-2/2012 则与日本、马来西亚、泰国等周边国家的一系列分离株亲缘关系较近，同属于B1a亚型。见图1。3 讨 论引起手足口病的病毒属于小RNA病
16、毒科肠道病毒属，包括柯萨奇病毒A组的2、4、5、7、9、10、16 型等，B组的1、2、3、4、5 型等，埃可病毒，EV71及 EV新的血清型，其中以EV71及CA16最为常见 5。二者常相伴引起手足口病的暴发或流行，但每次流行中两种病毒所占比例有所不同。近几年来，EV71成为手足口病尤其是重症病例的优势病原，有关EV71的流行病学和分子基因特征研究比较广泛，而关于CA16的报道相对较少。自 1951年南非分离到CA16原型株以来，日本、马来西亚和中国台湾等国家和地区都展开了对CA16的研究 6-7。1999 年深圳学者从手足口病患者中首次分离到中国的CA16 毒株，随后国内对CA16的研究逐
17、步展开。但迄今为止，中国的 CA16病毒学监测还比较薄弱，相关的研究及资料积累仍不够丰富。目前，国内外对CA16病毒的分子流行病学研究主要集中在外壳蛋白 VP1上，因为VP1蛋白不仅是病毒主要的免疫原性蛋白和抗体特异性中和位点，而且其核苷酸序列具有显著的基因多态性，还与病毒血清型密切相关，是病毒基因分型和遗传进化分析的最重要靶标，并可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考8。 2005年Li等 9对1999-2004年我国深圳CA16分离株进行了基于VP1的系统进化分析，将CA16分为A、B、C三个基因型，B 和C 基因型之间的核苷酸差异在5.8%-11%之间。2007年Perera等 10对亚
18、太地区分布于5个国家10年间的52株CA16分离株进行了系统进化分析，将CA16分为A 、B两个基因型，B基因型又可分为B1 、B2两个亚型，并认为Li等人划分的B、C基因型即其研究中的B1、B2两个亚型。基于 Perera 的分型标准，本研究从 GenBank 中选取 23 株代表不同国家不同年份的 CA16 代表株和 1 株 EV71 国际标准株 BrCr 作为组外对照，与 14 株CA16 江苏分离株 VP1 序列进行比对。结果显示：14 株 CA16 江苏分离株的VP1 区核苷酸和氨基酸序列高度同源，同属于 B1 基因型；其中 12 株与湖北、安徽、浙江和深圳等国内其它分离株构成亲缘关
19、系较近的一支，同属于 B1b 亚型；另外 2 株与日本、泰国和马来西亚等周边国家分离株亲缘关系较近，同属于 B1a 亚型。这提示江苏在 2012 年有 CA16 病毒的 B1a 与 B1b 两种进化分支共同存在与循环，且呈现以 B1b 基因亚型为优势型别、B1a 基因亚型为辅助型别的传播模式；无论是优势型别还是辅助型别，均各自呈现密切的亲缘关系。14 株 CA16 分离株与同属于 A 基因型的 G-10 国际标准株和安徽阜阳株 FY18相比在核苷酸水平和氨基酸水平都已经发生了较大的变化，但与同一时期同一基因型别国内国际 CA16 分离株的同源性较高，提示 CA16 分离株与分离时间的关系可能比
20、地域的关系更密切。Hosoya11等在研究中指出，CA16的变异是一个随时间迁移逐渐呈现遗传多样性的长期过程。在一个流行阶段内以某个基因群的毒株为主，下一个流行阶段又由新的基因群代替成为新的优势流行株。目前在中国大陆的CA16分离株与我国周边国家和地区的CA16流行株在基因亲缘关系和流行时间关系上都很接近12，江苏省2012 年CA16病毒与我国宁夏、河南和上海等省近几年的CA16病毒流行情况基本一致 13-15，占流行趋势的CA16病毒属于B1基因型，有B1a 和B1b两种亚型共同存在和流行。本研究丰富了国内CA16毒株的基因库和流行病学资料，为进一步深入阐明和认识CA16病毒的起源和进化奠
21、定了基础，同时为 HFMD的综合防治和CA16病毒的动态监测提供了参考依据。参考文献1 Chang LY, Lin TY, Huang YC, et al. Comparison of enterovirus 71 and coxsackie-virus A16 clinical illnesses during the Taiwan enterovirus epidemic, 1998J. Pediatr Infect Dis J, 1999, 18(12): 1092-10962 Wang CY, Li-Lu F, Wu MH, et al. Fatal coxsackievirus A1
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24、yoshi S, Iizuka S, Yamashita T, et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71J. J Virol, 2012, 86(10): 5686-56968 Shlmizu H, Utama A , Onnimala N, et al. Molecular epidemiology of enterovirus71 infection in the Western Pacific RegionJ. Pediatr Int, 200
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28、-140表 1 14 株 CA16 分离株与部分参考株 VP1 基因的核苷酸和氨基酸同源性（%）Tab 1 The homogeneity of nucleotide acid and amino acid of VP1 gene between 14 strains and the representative strains of CA16（ %）与江苏分离株比较的参考株 核苷酸同源性 氨基酸同源性G-10(CAU05876) 75.576.7 91.692.3FY18(EU812514) 75.076.3 90.290.9其余 21 株 CA16 参考株 89.798.9 99.0100BrCr（EV71 ） 65.166.0 70.771.0图 1 14 株 CA16 分离株与各亚型参考株之间 VP1 基因的进化树Fig 1 The phyligenetic tree of VP1 gene between 14 strains and the representative strains of CA16
