1、药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)前言药物体内代谢、转运及药物作用靶点基因的遗传变异及其表达水平的变化可通过影响药物的体内浓度和敏感性，导致药物反应性个体差异。近年来随着人类基因组学的发展，药物基因组学领域得到了迅猛发展，越来越多的药物基因组生物标记物及其检测方法相继涌现。药物基因组学已成为指导临床个体化用药、评估严重药物不良反应发生风险、指导新药研发和评价新药的重要工具，部分上市的新药仅限于特定基因型的适应症患者。美国 FDA 已批准在 140 余种药物的药品标签中增加药物基因组信息，涉及的药物基因组生物标记物 42 个。此外，部分行业指南也将部分非 FDA 批准的生物标记物及
2、其特性（如 MGMT 基因甲基化）的检测列入疾病的治疗指南。药物反应相关基因及其表达产物的分子检测是实施个体化药物治疗的前提。药理学与遗传学结合的关键环节包括药物代谢动力学（pharmacokinetics，PK）和药物效应动力学（pharmacodynamics ，PD ）两方面。药物代谢动力学主要是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律，侧重于阐明药物的体内过程；药物效应动力学主要研究药物对机体的作用、作用规律及作用机制，其内容包括药物与作用靶位之间相互作用所引起的生化、生理学和形态学变化，侧重于解释药物如何与作用靶点发生作用。对药物代谢酶和药物靶点基因进行检测可指导临床针对特定
3、的患者选择合适的药物和给药剂量，实现个体化用药，从而提高药物治疗的有效性和安全性，防止严重药物不良反应的发生。目前美国 FDA 和我国食品药品监督管理局（ CFDA）都已批准了一系列的个体化用药基因诊断试剂盒。这些试剂盒基本都是对人 DNA 样本进行基因检测。而在基因表达的检测方面，由于 RNA 的稳定性差，样本处置不当可导致目标 RNA 降解，使得检测结果不准确，影响临床判断。因此，RNA 检测试剂的研发相对滞后。本指南旨在为个体化用药基因检测提供一致性的方法。本指南中所指的药物基因组生物标志物不包括影响抗感染药物反应性的微生物基因组变异。此外，肿瘤靶向治疗药物个体化医学检测指南见肿瘤个体化
4、治疗的检测技术指南 。本指南起草单位：中南大学湘雅医院临床药理研究所、中南大学临床药理研究所、中南大学湘雅医学检验所，并经国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会、中国药理学会药物基因组学专业委员会、中国药理学会临床药理学专业委员会和中华医学会检验分会组织修订。本指南起草人：周宏灏、陈小平、张伟、刘昭前、尹继业、李智、李曦、唐洁、俞竞、彭静波、曹杉、成瑜。I目 录1.本指南适用范围 .12.药物代谢酶和药物作用靶点基因检测概述 .13.标准术语 .14.药物代谢酶和药物作用靶点基因检测分析前质量保证 .64.1 采样前准备 .64.2 标本采集 .74.3 标本的运输与保存 .94.4 标本
5、的接收与保存 .95.药物代谢酶和药物作用靶点基因检测分析中质量保证 .105.1 实验室设计要求 .105.2 检测方法 .115.3 仪器设备的使用、维护与保养 .175.4 人员培训 .175.5 检测体系的性能验证 .186.药物代谢酶和药物作用靶点基因检测分析后质量保证 .196.1.检测报告、解释及报告发放 .196.2 检测后样本的保存和处理 .237.药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的质量保证 .237.1 检测确认和特征描述 .247.2 可操作性的 SOP 编写 .247.3 质控品与室内质控 .247.4 室内质控的评价 .267.5 室间质量评价 .268.制度 .27
6、附录 A. 基因及突变名称、核酸信息 .28附录 B. 缩略语 .30附录 C. 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测项目列举 .33附录 D. 药物代谢酶和药物作用靶点基因相关的药物 .50参考文献 .5211. 本指南适用范围本指南由国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会制定，旨在为临床检验实验室进行药物代谢酶和药物靶点基因的检测提供指导。本指南的主要适用对象为开展个体化医学分子检测的医疗机构临床实验室。2. 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测概述药物代谢酶和药物作用靶点基因特性的变化可通过影响药物的体内浓度和靶组织对药物的敏感性，导致药物反应性（包括药物的疗效和不良反应发生）个体差异。药物
7、基因组生物标志物的检测是临床实施个体化药物治疗的前提。从药物代谢酶和药物作用靶点基因出发，对个体化用药基因检测的适应人群、标本采集、运输、接收、处理、样本检测、结果报告与解释、室内室间质控需遵循的基本原则，以及可能出现的问题与应对措施等方面的内容进行介绍，可为基于药物代谢酶和药物作用靶点的基因检测提供标准化指导。3. 标准术语3.1 Ct 值（threshold cycle）荧光定量 PCR 反应的荧光强度超过设定的阈值所需的循环数。Ct 值位于 PCR 反应的指数期初期，与标本中待测核酸分子的原始拷贝数呈反比，即样本中原始拷贝数越多，荧光强度升高的就越快，相应的 Ct 值就越小。3.2 RN
8、A（ribonucleic acid）核糖核酸，与 DNA 类似的单链核酸，由核糖核苷酸按照一定的顺序排列而成，含尿嘧啶而不含胸腺嘧啶，存在于细胞质和细胞核中，在细胞蛋白质的合成及其他化学活动中起重要的作用。RNA 分子包含信使 RNA（mRNA ） 、转运 RNA（tRNA ） 、核糖体 RNA（rRNA）和其他小 RNA 等多种类型，分别行使不同的功能。各种 RNA 的混合物称为总 RNA。3.3 rs 和 ss 体系 SNP由美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）建立、 dbSNP 数据库制定的 S
9、NP 命名体系，rs 体系的 SNP 代表已获得官方认可和推荐的参考 SNP（reference SNP） ，ss 体系的 SNP 代表用户新递交但尚未得到认可的 SNP（submitted SNP） 。 3.4 TE 缓冲液TE 缓冲液由 Tris 和 EDTA 配置而成，主要用于溶解 DNA，能稳定储存 DNA。23.5 错配修复（mismatch repair，MMR ）在含有错配碱基的 DNA 分子中，使正常核苷酸序列恢复的核甘酸修复方式，这种类型的修复可纠正 DNA 双螺旋上错配的碱基对，还可修复因复制打滑而产生的核苷酸插入或缺失。MMR 的过程需要区分母链和子链，做到只切除子链上错
10、误的核苷酸，而不会切除母链上的正常核苷酸。修复的过程是：识别出正确的链，切除掉不正确的部分，然后通过 DNA 聚合酶 III 和 DNA 连接酶的作用，合成正确配对的双链 DNA。3.6 单核苷酸多态性（SNP）是指由单个核苷酸A、T、C 或 G 的改变而引起的 DNA 序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。3.7 等位基因一般是指位于一对同源染色体相同位置上控制某一性状的不同形态的一对基因。若成对的等位基因中两个成员完全相同，则该个体对此性状来说是纯合子。若两个等位基因各不相同，则该个体对该性状来说是杂合子。3.8 5-氟尿嘧啶一种嘧啶类似物，作为胸苷酸合成酶抑制剂，阻
11、断 DNA 复制的必需原料胸腺嘧啶的合成。主要用于肿瘤的治疗。3.9 光密度表示紫外光照射下被检测物吸收的光密度，260nm 波长下的吸光值（DNA 吸收峰值）可用来表示 DNA 的相对浓度，具体换算公式为：DNA 浓度（ng/ l）=OD 260 X 50 X 稀释倍数。3.10 基因芯片将大量（通常每平方厘米点阵密度高于 400）的核酸探针分子固定于支持物上并与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。3.11 基因是遗传物质的最小功能单位，是指具有一定生物学意义的一段 DNA。3.12 基因型又称遗传型，是某一生物个体全部基因组合的总称，
12、它反映生物体的遗传构成，即从双亲获得的全部基因的总和。据估计，人类的结构基因有 3 万个。因此，整个生3物的基因型是无法表示的，遗传学中具体使用的基因型，往往是指某一性状的基因型。3.13 基因组生物标志物是一种可用于指示正常生物学过程、病理过程和/或对治疗及其他干预措施反应性的可测量的 DNA 或 RNA 特性。其中 DNA 的特性可包括但不仅限于单核苷酸多态性、短序列重复次数多态性、单倍型、DNA 修饰如甲基化、核苷酸的插入/缺失、拷贝数变异及细胞遗传学重排如转位、重复、缺失或反转。RNA 特性包括但不仅限于 RNA 序列、RNA 表达水平、RNA 处理过程（如剪接和编辑） 、微小 RNA
13、。3.14 检出限（limit of detection，LOD）标本中一种分析物可被检出的最低的含量，这一分析物含量可能不是量化的具体数值。3.15 健康保险隐私及责任法案（health insurance portability and accountability act，HIPAA）美国政府 1996 年颁布的、医疗服务行业必须遵守的法案。该法案制定了一系列安全标准，就保健计划、供应商及结算中心如何以电子文件的形式传送、访问和存储受保护的健康信息做出了详细的规定。3.16 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）简称 PCR 技术，是一种体外扩增特异
14、DNA 片段的技术，应用该技术可以在短时间内将一个或几个 DNA 拷贝扩增到百万数量级。3.17 临床检验实验室是指对取自人体的各种标本进行生物学、微生物学、免疫学、化学、血液免疫学、血液学、生物物理学、细胞学等检验，并为临床提供医学检验服务的实验室。3.18 灵敏度（sensitivity）测量系统的示值变化除以相应的被测量值变化所得的商。3.19 室内质量控制实验室内进行的用于满足质量要求的操作技术和活动。3.20 室间质量评价室间质量评价是多家实验室分析同一标本，并由外部独立机构收集和反馈实验室上报结果、评价实验室操作的过程，也称能力验证。43.21 脱氧核糖核酸（DNA）核酸的一种，是
15、由特殊序列的脱氧核糖核苷酸单元（dNTP）构成的多聚核苷酸，起携带遗传信息的功能。DNA 为一种双链分子，通过核苷酸碱基对间的氢键维系。DNA 包含的 4 种核苷酸包括：腺嘌呤（A） 、鸟嘌呤（G ） 、胸腺嘧啶（T ）和胞嘧啶（G） 。人类存在两种类型的 DNA：来自染色体的基因组 DNA（gDNA ）和线粒体DNA。3.22 能力验证（proficiency testing，PT）多个标本周期性地发送到实验室进行分析和（或）鉴定，将每一实验室的结果与同组的其他实验室的结果或指定值进行比较，并将比较结果报告给参与的实验室，同室间质量评价。3.23 生物标记物（biomarker）患者标本中所
16、含有的一种特殊的分析物质（如 DNA、RNA 、蛋白质等） ，可用于疾病诊断、判断疾病分期或评价新药或新疗法在目标人群中的安全性和有效性。3.24 微卫星指基因上含有重复的 DNA 短小序列或单核苷酸的区域，每个单元长度在 1-6 bp 之间。根据重复单元的构成与分布，微卫星 DNA 序列可分为 3 种类型：单一型、复合型和间断型。3.25 微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）是指肿瘤基因组特定的微卫星位点与其对应的非肿瘤基因组相比，因重复单位的缺失或插入而造成的结构性等位基因的大小发生改变，出现新的微卫星等位基因现象。3.26 线性在已知的范围内，某
17、检测提供的结果能够直接与标本的浓度（或量值）成比例关系的能力。3.27 相对定量通过标准曲线法和 CT 值比较法测定目的基因的相对表达量，以比较两个或多个样本中目的基因的表达差异。该方法通常用来检测基因表达量是上调还是下降。3.28 遗传药理学研究机体的基因多态性对药物反应个体差异的影响，是药物基因组学的重要内容。53.29 药物不良反应（adverse drug reaction, ADR）是指上市的合格药品在常规用法、用量情况下出现的，与用药目的无关，并给患者带来痛苦或危害的反应。3.30 药物的反应性包括药物吸收和分布（即药代动力学） 、药物效应（如药物效应动力学） 、药物的疗效及药物不
18、良反应。3.31 药物基因组学研究人类基因组信息与药物反应之间的关系，同时也可以发现药物新靶点和提高临床试验的成功率。3.32 荧光定量 PCR通过应用荧光染料或荧光标记的特异性探针，对聚合酶链反应产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，结合相应的软件可以对荧光信号进行分析，实现基因检测的定性和（或）定量分析。3.33 荧光原位杂交（FISH）一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。荧光标记的核酸探针只与具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位和定量。3.34 杂交两个以上的分子具有相近的化学结构和性质而在适宜的条件下形成杂交体，杂交体中的分子不是来自一个二聚体分子。利用两条不
19、同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链被称为核酸杂交。3.35 知情同意（informed consent）患者有权利知晓自己的病情，并可以对医务人员所采取的治疗措施和临床检测项目有决定取舍的权利。3.36 控制品仅用于质量控制目的而不是用于校准分析的标本或溶液。3.37 准确度（accuracy ）是测量结果中系统误差与随机误差的综合，表示测量结果与真值的一致程度。3.38 正确度（trueness）无穷多次重复测量所得量值的平均值与一个参考量值间的一致程度。63.39 精密度（precision）是指在一定条件下进行多次测定时，所得测定结果之间的符合程度，表示测量结果中的随机
20、误差大小的程度。3.40 特异性（specificity）在出现干扰现象（影响量）时，试验或检测程序能够正确地识别或定量确定某一实体物质的能力。4. 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测分析前质量保证根据临床检验实验室的条件确定合适的分子诊断项目和恰当的样本处理是确保核酸定性定量检测准确性的关键。标本在检测前必须确保标本的采集、运输和储存符合要求。标本处置不当可能引起核酸降解，导致定量检测结果不准确。4.1 采样前准备1）分子诊断项目的申请与完善药物代谢酶和药物作用靶点基因检测采样前需填写规范的申请单，申请单应包含足够的信息，以识别患者和有资格开具申请单的临床医生。临床医生应根据临床需求合理选择分
21、子诊断项目。个体化用药领域发展迅速，临检实验室应加强与临床医师的沟通，及时指导临床医师选择有价值的诊断项目，帮助医师合理解释检验结果；不断接受正确合理的临床医师的反馈意见，及时了解临床对个体化用药分子检测的需求，优化项目目录。实验室应根据其具体的工作流程，确定质量监测指标，如患者诊断信息完整率、适当临床判断率等，并定期对数据进行回顾性分析，定期对检验申请进行评审。2）患者的正确识别及知情同意患者的正确识别是确保获得正确的临床标本的前提。收集标本的容器上应注明患者的信息，通常应包括姓名、送检医院及科室、住院号等。医护人员在采样前需首先核对确定患者的身份，核实能标示患者的信息。标本收集前应向患者介绍个体化用药基因检测的意义，以得到患者的认同，即知情同意。采样前需告知患者所检测项目的目的、意义、基本过程、项目可能存在的不足如检测结果可能出现与临床用药实际不相符的情况、剩余核酸的去向（包括可能匿名用于科研项目）及保存时间，保护受检者的个人隐私（包括医疗记录和医疗数据）。对实施有创检查的分子诊断项目如穿刺取活检组织，应清楚地告知患者及家属检查可
