1、本科毕业论文（20 届）大血藤黑斑病的病原鉴定与生物防治所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I目录目录 .I摘要 .IIAbstract.IIKeywords.II0 前言 .11 材料与方法 .11.1 材料来源 .11.2 菌种来源 .11.3 培养基 .11.4 试剂 .11.5 仪器设备 .22 实验方法 .22.1 病症的观察与描述 .22.2 显微镜检查 .22.3 病原菌的分离与培养 .22.4 病原菌的鉴定 .23 结果与分析 .23.1 病症的观察与描述 .23.2 病原菌的培养性状及形态 .33.3 显微镜的镜检及病原鉴定 .34
2、 讨论与结论 .4参考文献 .6致谢 .9II大血藤黑斑病的病原鉴定与生物防治摘要：本文通过对大血藤（ Sargentodoxa cuneata）病症的观察，采用组织分离法分离得到病原菌，通过对病原菌的菌落的形态特征的观察和孢子的大小的测定，鉴定出引起凯里市大血藤病害的是黑斑病，其病原菌为链格抱属(Alternaria Neesex Fr.)，其孢子多数为多隔袍链格袍。本文针对大血藤黑斑病选择了三种枯草芽苞杆菌( Bacillus sp.)制剂进行生物防治实验，比较它们的抑菌效果, 结果显示：枯草芽孢杆菌 F1 制剂对这种病菌的防治效果最好，其次是 F18，F2 防治效果最差。关键词：大血藤；
3、黑斑病；生物防治；链格袍属；枯草芽苞杆菌Disease Research and Pathogen Identification of Black Spot Disease of Sargentodoxa cuneataAbstract: In this artical Sargentodoxa cuneata disease was observed and the pathogen were isolatied using tissue surface isolation method , Sargentodoxa cuneata disease was determined by the
4、 size of the observation of the morphological characteristics of the colonies of pathogens and spores, Kaili City cuneatathe disease is black spot, and its pathogens Chains hold the genus (Alternaria Neesex Fr.) the majority of its spores for the multi-compartment gowns chain grid gowns. In This art
5、icle three hay buds bacillus (Bacillus sp.) was selected for biological control experiment of Sargentodoxa black spot diease and their antibacterial effect was compared,the reasult showed:the control effect of Bacillus subtilis F1 preparation for this pathogen was the best, followed F18, and the F2
6、prevention was the worst .Keywords: cuneata; black spot; biological control; chain grid gowns are; buds subtilis bacteria10 前言大血藤（Sargentodoxa cuneata）为大血藤科大血藤属落叶木质藤本，是我国比较古老、原始的特有植物 1，是亚热带（西南地区）落叶阔叶林的代表树种，主要生长在贵州、四川、江西、河南、安徽等地的山坡疏林、溪边，现已有栽培 2。中药以藤茎为主，有活血通经、清热解毒及祛风除湿等功效，可以治疗经闭痛经、肠痈腹痛、跌打扑痛、风湿痹痛 3。大血藤
7、中含有多种酚类及酚苷类化合物，大黄素甲醚(physcion) ，大黄素(emodin)，原儿茶酸(protocatechuic acid)，大黄酚(chrysophanol) ， -谷甾醇(-sitosterol) ，香草酸(vanillicacid)和红藤多糖等活性成分 4-5。黑 斑 病 是 危 害 植 物 普 通 病 害 ， 对 多 种 植 物 有 严 重 的 危 害 作 用 ， 危 害 范 围广 ， 遍 及 世 界 各 地 ， 我 国 近 几 年 更 为 严 重 6； 危 害 程 度 重 ， 一 旦 植 株 感 染 上 ，就 会 迅 速 蔓 延 至 整 个 植 株 ， 甚 至 传 染
8、到 相 邻 的 植 株 7； 黑 斑 病 不 仅 影 响 植物 本 身 的 生 长 发 育 ， 严 重 的 降 低 了 农 作 物 和 中 药 的 品 质 ， 造 成 巨 大 的 经 济 损失 8， 还 对 人 体 健 康 产 生 危 害 9。 黑 斑 病 多 发 生 于 温 暖 潮 湿 的 多 雨 季 节 10，贵 州 黔 东 南 州 一 年 四 季 都 是 潮 湿 多 雨 气 候 11， 随 着 黔 东 南 州 大血藤种 植 面积 的 扩 大 ， 黑 斑 病 已 经 成 为 大 血 藤 病 害 的 主 要 病 害 之 一 。 因 此 ， 本 文 对 大血藤进 行 初 步 的 病 害 分 析
9、 ， 简 要 提 出 对 大血藤黑斑病的 防 治 措 施 ， 以 期 为 贵州 省 黔 东 南 州 大血藤病 害 具 有 一 定 的 参 考 价 值 。1 材料与方法1.1 材料来源在贵州省黔东南苗族侗族自治州锦屏县启蒙镇玉泉村采集大血藤病害组织叶，将其放入保鲜袋内备用。1.2 菌种来源 将 采 集 来 的 大血藤病 叶 通 过 组 织 分 离 法 分 离 实 验 分 离 获 得 12。1.3 培养基 2,12,13-14PSA 培 养 基 ： 马 铃 薯 200 g， 洗 净 、 去 皮 、 切 碎 ， 加 水 1000 ml 煮 沸30 min， 过 滤 ； 在 滤 液 中 加 入 蔗 糖
10、 10 20 g 和 琼 脂 17 20 g， 溶 解 后 趁 热过 滤 ； 将 溶 液 分 装 到 试 管 和 三 角 瓶 中 ； 121 高 温 灭 菌 20 min 冷 却 备 用 。1.4 试剂 2,12,13-14275%乙醇、0.1%升汞、链霉素、无菌水。1.5 仪器设备 2,12,13-14 恒温培养箱、电磁炉、高压蒸汽灭菌锅、微波炉、光学显微镜、目镜测微尺、冰箱及其他实验仪器。2 实验方法2.1 病症的观察与描述观察病害组织的病斑形态、病斑大小、病斑颜色等特征，并详细记录与进行拍照。2.2 显微镜检查 2,12,13-14显微镜检查分为真菌病害标本和病原菌的显微镜检查两个方面，
11、观察菌落的形态结构、菌落的大小、菌落的颜色等特征，并对菌丝是否分支、是否有隔等特征进行显微观察。同时，对部分病菌在多媒体教室数码显微镜下拍摄照片，进行记录。2.3 病原菌的分离与培养 2,12,13-14组织分离法分离大血藤的病叶得到病原菌。切取病健交界处的叶组织 2-4 mm 的小块，置于 70%乙醇中浸 2 s，后移入 0.1%的升汞溶液中浸 2 min，再移到无菌水中漂洗 3 遍， 最后移到 PSA 培养基上培养，每个培养皿放置 3 块，倒置培养，在 25-30的电热恒温箱里培养 3-5 d 后， 挑取组织周围的菌丝放进加有链霉素的培养基平板上继续培养，5-7 d 后，将获得的纯培养进行
12、菌落性状的观察、描述和拍照。2.4 病原菌的鉴定 2,12,13-14对大血藤病原菌的鉴定采用传统的光学显微镜观察法。用灭菌后的接种针挑取少许菌丝，放在加有浮载剂（水）的载玻片，盖上盖玻片，置于显微镜下观察。观察菌丝的颜色，是否有隔，是否有分支等特征；并观察分生孢子的颜色，形态结构。记录和拍照。3 结果与分析3.1 病症的观察与描述大血藤黑斑病发病主要部位是叶片、果实。病斑开始时圆形或椭圆形，初为紫褐色，渐变黑褐色，病部稍下陷，以后各病斑互相融合，融合后成不规则3形，暗褐色至黑色；嫩叶往往皱缩变形。病斑大小 0.1-0.8 cm0.3-1.1 cm，有明显的病健交界 （图 1） ，发病严重时整
13、片叶子都会烂掉然后脱落 15。3.2 病原菌的培养性状及形态在 PSA 培养基上，病原菌生长较快，菌落成辐射状生长，边缘整齐。菌丝白色，后变成黑褐色。菌落初期为乳白色，成絮状或绒状（图 2、图 3） 。3-4 d后，菌落中央开始出现灰色并逐步变黑。3.3 显微镜的镜检及病原鉴定多隔孢链格孢的分生孢子梗单生，不分枝，淡褐色，216(5)个隔膜，23.0165.8(54.8)um2.8 8.9(4.7)um；分生孢子呈链状，形状为圆筒形至倒棍棒形，颜色为淡褐至褐色，孢子表面光滑或具微刺，有 27(大部分 35)个横隔膜，偶尔有 1 个纵隔膜或斜隔膜，横隔膜处缢缩，中央的一个横隔膜缢缩特4别明显，隔
14、膜亦较厚，孢身尺度 15.143.4(31.9)um5.912.5(8.7)um ；喙2.817.6(7.9)um2.65.1(3.8)um，喙顶有明显黑色疤痕 16-17（图 5、图 6） 。根据以上特征，鉴定该病原菌为半知菌纲链孢霉目黑霉科链格孢属的链格孢属真菌（Alternaria alternata） 。图 5 大血藤链格孢属分生孢子（1040） 图 6 大血藤链格孢属菌丝（1040） 3.4 生防菌的作用用三种枯草芽孢杆菌制剂对链格孢霉真菌进行生物防治的结果表明：枯草芽孢杆菌 F1 制剂对两种病菌的防治效果最好，其次 F18 相对较好，F2 防治效果较低（图 7） 。4 讨论与结论5
15、通过对采集到的大血藤黑斑病病株标本样株进行分离、培养和纯得到病原菌，经形态学鉴定表明，引发大血藤黑斑病的病原菌为为半知菌纲链孢霉目黑霉科链格孢属的链格孢属真菌（Alternaria alternata） 。链格孢属真菌能在多种植物上侵染引起黑斑病，是植物叶部病害的常见病原菌之一 18，但大血藤黑斑病还是首次出现，对大血藤的病害研究的相关文章中仅见关于炭疽病的报道 2，可以说大血藤黑斑病是大血藤病害中新型的病害。三种枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）制剂对链格孢属真菌抑制效果表明：（1）不同的枯草芽孢杆菌对链格孢属真菌的抑制效果不同；（2）生物制剂能有效的抑制链格孢属真菌生长；（3）链格孢
16、属真菌生长跟环境有很大的联系，在潮湿温暖的环境下特别适宜生存和繁殖。大血藤是贵州有名的中药，黑斑病对其影响在日益加重，为满足市场的需求，培育出优质品质的大血藤中药，必须对大血藤黑斑病进行预防和防治。（1）农业防治：实行合理管理制度，推广无病试管苗，及时合理追肥，提高抗病力，注意清除病害植株和杂草，与其他作物进行轮种，随时防治害虫，减少病菌传播途径 19-20。（2）药剂防治：用种子重量03%的50%异菌脲可湿性粉剂，或50%福美双可湿粉剂等进行拌种。发病初期喷施50%异菌脲可湿性粉剂1000-1500倍，或50%福美双可湿粉剂800倍。保护地在发病初期采用粉尘法、烟雾法等方法 20。（3）生物
17、防治：应用相关的生物抑制剂进行防治，如枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）制剂。6参考文献 1 盛仙永，刘文哲.大血藤属植物研究进展J .西北植物学报，2003, 23(7) : 11161120.2 张国辉，蔡凌云，张文华，等.大血藤炭疽病的病原鉴定及病害分析J.中国农学通报，2012，28(15):207-210.3 陈智仙，高文远，刘岱琳，等.大血藤的化学成分研究（）.中草药，2010,40(6):867-890.4 邓翀,颜永刚.多指标综合评价优选大血藤酚酸类化合物的提取工艺J.中国实验方剂学杂志，2011,17（13）:12-14.5 尹泉 ,李惠芬,周群,等.大血藤药材及不同提
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