1、正交设计法优选六月青多糖胶囊提取工艺葛文漪，黄建春，陈兆霓，焦阳，张士军，黄仁彬*(广西医科大学药理学教研室，南宁 530021)摘要 目的：优选六月青多糖胶囊提取工艺的最佳条件。 方法：选用 L9(34)正交试验设计方法，分别对水煎煮及醇沉两个步骤进行优选，以多糖含量为水煎煮工艺评价指标；采用苯酚-浓硫酸法测定总多糖含量，以多糖含量和收率为醇沉工艺综合评价指标，确定最佳提取工艺参数。结果：六月青多糖胶囊最佳提取工艺为生药材加 10 倍量水，每次煎煮 2 h，煎煮 3 次。水提液过滤、合并、浓缩至含生药 0.5 gmL-1，7 倍量 95%乙醇沉淀 12 h，沉淀 1 次。结论：优选出的工艺条
2、件 ,经验证其结果稳定、合理，可作为六月青多糖胶囊的最佳提取工艺。关键词 六月青胶囊；正交试验；提取工艺；煎煮法；醇沉法Optimization of Extraction Technology for Liuyueqing Polysaccharides Capsule by Orthogonal DesignGE Wen-yi, HUANG Jian-chun, CHEN Zhao-ni, JIAO Yang, ZHANG Shi-jun, , HUANG Ren-bin(Department of Pharmacology, Guangxi Medical University, Nan
3、ning 530021, China)Abstract Objective: To optimize the technology of extraction for Liuyueqing polysaccharides capsules. Method: The technical conditions for the water decoction and the alcohol precipitation were optimized respectively by orthogonal experiment design L9 (34). The content of polysacc
4、harides was used as the index for the water decoction, the content of polysaccharides and extract rate were used as indexes for alcohol precipitation. The method of phenol-sulfuric acid reaction was used in determining the content of polysaccharides. Optimal process control parameters were_收稿日期 基金项目
5、 广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻 10124008-6，桂科攻 0992003A-2，KFJJ2010-22)第一作者 葛文漪，硕士研究生，从事药物质量控制和生化药理学研究，Tel:15994443433, E-mail:通讯作者 *黄仁彬，教授，博士研究生导师，从事抗病毒性肝炎药物和生化药理学研究，Tel: 0771-5339805,E-mail: determined. Result: The optimal conditions for Liuyueqing polysaccharides capsules were as follows: decocting the crude
6、 drugs three times with 10-fold water, 2 hours each time. The physic liquor extracted by water was filtered, mixed and concentrated to 0.5 gmLl-1(crude drug), and then precipitated by 7-fold 95% alcohol one time for 12 hours. Conclusion: The result of this optimized extraction procedure is proved to
7、 be stable and reliable, it can be used as the optimal extraction procedure of Liuyueqing polysaccharides capsules.Key words Liuyueqing polysaccharides capsules, orthogonal experiment design, extractiontechnology, decoction method, alcohol-precipitation method六月青为广西特色民间草药，系爵床科(Acanthaceae) 肖鸡笼属植物肖鸡笼
8、（顶花马兰）Taraphochlamys affinis(Giff) Bremekhu 的干燥地上部分。在 本草拾遗中记载，其能活血、凉血、疏肝泻湿、消肿止痛，主要用于急慢性肝炎、黄疸等 1。经前期实验结果表明，六月青总多糖作为六月青的活性成分之一，具有明显的体外抗氧化作用，对四氯化碳所致小鼠急性化学性肝损伤及刀豆蛋白 A 致免疫性肝损伤均具有显著的保护作用，并能减轻四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化，其作用机制可能与抗氧自由基、抑制脂质过氧化，抑制肝脏胶原纤维的合成和沉积有关 2。六月青多糖胶囊系根据中医理论和民间治疗肝炎经验研制的一种纯中药单方制剂，由六月青总多糖及相应辅料组成。本研究为尽可能完全
9、提取出六月青生药材中活性成分总多糖，依据正交试验设计原理，分别对水煎煮和醇沉两个工艺步骤进行考察 3-5，优选最佳水提醇沉提取工艺，为六月青多糖胶囊制剂的开发研究提供工艺支持和科学依据。1 仪器与试药722S 可见光分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），EL204 METTLER TOLEDO 电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），RE-5210A 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），DHJF-2005 低温恒温搅拌反应浴(郑州长城科工贸有限公司)，DZF-300 真空干燥箱(郑州长城科工贸有限公司)。六月青生药材（采于广西灵山县，经广西中医药研究院赖茂祥研究员鉴定），D-无水葡萄糖对照品（
10、中国药品生物制品检定所，110833-200904），水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 六月青多糖含量测定2.1.1 对照品溶液的配制： 精密称取 105 干燥至恒重的葡萄糖对照品 20 mg ,置于 100 mL 容量瓶中，以蒸馏水溶解并定容至刻度，混匀，即得 0.20 gL-1 对照品储备液。2.1.2 供试品溶液的配制：精密称取六月青多糖样品 40 mg ,加蒸馏水溶解，定容于 100 mL容量瓶，即得供试品溶液。2.1.3 标准曲线的绘制：精确吸取对照品储备溶液 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL 分置于 10 mL 具塞玻璃试管中,蒸馏水稀释至 2.0
11、mL，摇匀，另取蒸馏水 2.0 mL 于试管中作为空白对照，分别加入 6%重蒸苯酚溶液 1 mL，沿壁迅速滴加浓硫酸 5 mL，旋涡混匀，沸水浴中加热 10 min，冷却至室温后，于 490 nm 处测定吸光度值，平行操作 3 次取其平均值。以吸光度 A对葡萄糖质量浓度 C（mgL -1）作回归处理，绘制葡萄糖标准曲线。回归方程A=0.0074C+0.0705，R 2=0.9996，表明葡萄糖质量浓度在 20100 mgL-1 吸光度呈良好的线性关系。2.1.4 精密度试验：精密量取对照品溶液 1 mL 于 10 mL 具塞玻璃试管中，按 2.1.3 项下的方法操作，连续 5 次测定其吸光度，
12、RSD 为 0.82%，仪器精密度符合要求。2.1.5 重复性试验：取六月青总多糖细粉 6 份，依 2.1.2 项下方法配制供试品溶液，按 2.1.3项下的方法操作分别测其吸光度值，得出六月青总多糖平均含量为 65.36%，RSD 为1.34%，说明重复性良好。2.1.6 稳定性试验：精确量取同一供试品溶液 1 mL,分别于配制后的 0.5，1，2，4，8，12 h，按 2.1.3 项下方法测定吸光度值，RSD 为 1.05%，说明供试品在 12 h 内稳定。2.1.7 加样回收率的测定：精密称取已知含量的六月青多糖 6 份，分别精密加入葡萄糖对照品适量，按 2.1.2 项下方法配制供试品溶液
13、，按 2.1.3 项下的方法操作测其吸光度值，算得平均回收率为 99.04%，RSD 1.65%，表明该法系统误差小，准确度较高。2.1.8 换算因子的测定：精密称取精制六月青多糖粉末 50 mg，置于 100 mL 容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，取 1.0 mL，按 2.1.3 项下的方法测定吸光度值，依下式计算换算因子：f=m/（ CD），式中：m 为称取多糖的质量（mg），C 为多糖液中葡萄糖的浓度（mgL -1），D 为多糖的稀释倍数 6。测得换算因子为 1.1367。2.1.9 样品含量测定：精密称取由正交设计不同工艺制备的六月青多糖细粉 50 mg，置 100 mL 容量瓶中
14、，加蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取 1.0 mL 溶液，按 2.1.3 项下的步骤操作测定吸光度值，带入回归方程，得葡萄糖浓度（mgL -1），按公式：六月青多糖含量（%）= CDf/W100%6，计算六月青总多糖的含量， 式中 C 为样品溶液中葡萄糖浓度（mgL -1），D 为样品溶液的稀释倍数，f 为换算因子；W 为称取的样品重量(mg)。2.2 水煎煮工艺正交试验2.2.1 正交设计表：根据六月青生药材性质及预试验的结果，按料液比（A）、煎煮次数（B）和煎煮时间（C）作为 3 个主要因素，每个因素备选 3 个水平（详见表 1），采用L9(34)正交表安排试验，以 多糖含量 为考察
15、指标，对水煎煮提取工艺进行优选。表 1 水煎煮提取正交试验因素水平表因 素水平A B/次 C/h 空白1 1:6 1 1 12 1:8 2 1.5 23 1:10 3 2 32.2.2 吸水率的测定：称取干燥六月青生药材 200 g，平行 3 份，加 6 倍水浸泡，每隔 0.5 h观察 1 次浸透程度，滤出未被吸收的药液，测定药渣湿重，直至质量不增加为止。按公式：吸水率%=（药渣湿重-药材干重） /药材干重100% ，计算药材吸水率 。3 次试验中，药渣湿重分别为 406.16, 402.57, 404.39 g，计算得出六月青药材平均吸水率为 102.26 %，即首次应多加入 1 倍量的水。
16、2.2.3 试验方法：按处方称取六月青生药材 27 份（每组试验平行操作 3 次），每份重 200 g，按正交试验表设计，分别加入不同倍量水，煎煮不同时间和次数，煎煮液趁热过滤，合并滤液，旋转蒸发仪浓缩，并定容至 400 mL（即每 1 mL 浓缩液相当于含生药 0.5 g），按 2.1.9 项下的方法测定多糖含量。2.2.4 正交试验结果与分析：表 2 水煎煮工艺正交试验结果因 素 评价指标试验编号 A B C D 多糖含量/%1 1 1 1 1 19.452 1 2 2 2 23.183 1 3 3 3 27.094 2 1 2 3 21.955 2 2 3 1 25.716 2 3 1
17、2 24.437 3 1 3 2 27.488 3 2 1 3 25.389 3 3 2 1 30.12K1 23.240 22.960 23.087 25.093K2 24.030 24.757 25.083 25.030K3 27.660 27.213 26.760 24.807R 4.420 4.253 3.673 0.286表 3 水煎煮工艺方差分析结果变异来源 离差平方和 SS 自由度 V 均方 MS F PA 11.112 2 5.556 245.125 0.01B 9.118 2 4.559 201.132 0.01C 6.764 2 3.382 149.199 0.01D（误差
18、）0.045 2 0.022F0.05（2,2）=19；F 0.01（2,2）=99由表 2，3 可知，A,B,C 三因素对多糖含量的影响均具有统计学意义上的显著性差异（P 0.01），影响因素大小顺序为 A B C，最终确定水煎煮最佳工艺条件为 A3B3C3，即加水量为生药材的 10 倍量（首次加入 11 倍），煎煮 3 次，每次煎煮 2 h。2.3 醇沉工艺研究2.3.1 正交试验设计：依据单因素试验考察多糖存留量的结果，按加醇量（A）、醇沉浓度（B）、醇沉时间（C）和醇沉次数（ D）4 个因素，每个因素选取 3 个水平进行正交设计（详见表 4），采用 L9(34)正交表安排试验，以收率和
19、多糖含量为综合评分指标 7，对醇沉工艺进行优选。表 4 醇沉工艺正交试验因素水平表因 素水平A/倍 B /% C /h D/次1 5 95 24 12 6 85 12 23 7 75 8 32.3.2 试验方法：称取六月青生药材，以水煎煮工艺最佳方案，加 10 倍量水煎煮 3 次，每次 2 h，水提液过滤，合并滤液，旋转蒸发仪中浓缩至含生药 0.5 gmL-1，均分成 27 份（每组试验平行操作 3 次）,按正交试验表 5 中的条件置 4 冰箱进行醇沉，4000 rmin-1 离心15 min，抽滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤，即得六月青总多糖，干燥，称量，计算多糖收率。合并上清液，减压回收
20、乙醇。2.3.3 正交试验结果与分析：表 5 乙醇沉淀正交实验设计表及结果因 素 评价指标试验编号 A B C D 收率/% 多糖含量/%综合评分1 1 1 1 1 4.14 64.38 84.262 1 2 2 2 4.60 57.21 76.953 1 3 3 3 3.80 53.05 70.304 2 1 2 3 3.33 59.19 76.385 2 2 3 1 3.82 41.72 57.196 2 3 1 2 5.58 49.08 69.737 3 1 3 2 8.82 52.56 81.138 3 2 1 3 5.26 58.85 80.379 3 3 2 1 4.06 68.7
21、9 89.21K1 77.170 80.590 78.120 76.887K2 67.767 71.503 80.847 75.937K3 83.570 76.413 69.540 75.683R 15.803 9.087 11.307 1.204综合评分=（收率/最大收率） 20+（多糖含量/ 最大多糖含量）80 8。表 6 乙醇沉淀正交实验结果方差分析变异来源 离差平方和 SS 自由度 V 均方 MS F PA 126.376 2 63.188 156.989 0.01B 41.373 2 20.687 51.395 0.05C 69.631 2 34.815 86.498 0.05D（误
22、差） 0.805 2 0.403 1.000F0.05（2,2）=19；F 0. 01（2,2）=99依表 5 直观分析显示，以极差最小的 D 因素为误差项进行方差分析可知，因素A，B ，C 对试验结果影响均具有统计学意义上的显著性差异（P0.05），各影响因素大小顺序为 A C B D，最终确定乙醇沉淀工艺最佳条件为 A3B1C2D1，即加 7 倍量 95%乙醇沉淀 1 次，时间为 12 h。2.4 验证试验：为确证六月青总多糖提取工艺的优劣及稳定性,在上述正交试验的基础上,按筛选出的最佳工艺条件,进行了重复验证试验。取干燥六月青生药材，分别加入11,10,10 倍量蒸馏水煎煮 3 次，每次
23、 2 h，水提液过滤，合并，浓缩至含生药 0.5 gmL-1 的药液；所得浓缩液加入 7 倍量 95%的乙醇沉淀，4 静置 12 h，醇沉 1 次，将提取液及沉淀以 4000 rmin-1 离心 15 min，抽滤取沉淀，无水乙醇、丙酮洗涤 , 40 干燥至恒重，粉碎，即得。重复提取 3 次，六月青多糖含量分别为 70.13%，71.09% ，71.94%，依公式：六月青总多糖提取率%=（多糖重量 多糖百分含量）/六月青药材投入量100% 9，计算多糖提取率平均值达 6.83%， RSD 为 1.25%，说明该提取工艺稳定可行。3 讨论多糖是一类由单糖分子经脱水以苷键缩合而成的天然高分子化合物
24、，一般为非晶形。提取多糖常用水，稀酸或稀碱等，由于酸、碱度较难控制，易影响提取效果 10，本研究以水作为溶媒，利用多糖易溶于水，难溶于一定浓度的乙醇，将六月青先用热水浸提，再以乙醇沉淀即得。通过正交设计，对水提醇沉工艺进行优化，以多糖含量和得率作为综合考察指标，对两项指标进行加权求和得到综合评分，使结果分析更为客观。由水煎煮试验方差分析得知，加水量和煎煮次数对多糖含量影响很大，溶剂体积增加了介质推动力，新溶剂的多次加入使渗透压变大，均利于多糖的溶出，适宜的条件有助于节约能源，提高生产效率。乙醇作为沉淀剂，其加入量、浓度大小，醇沉次数、时间和温度等均与沉淀是否完全密切相关。醇沉试验方差分析显示，
25、乙醇加入倍数和浓度、静置时间对总多糖得率影响显著，浓度过低易致多糖不能充分从提取液中析出，充足的醇沉时间和适当的次数既能减少原料消耗又能增加多糖有效析出。4 环境下醇沉时，能进一步降低多糖在醇溶液中的溶解度，提高多糖得率。多糖的含量测定是多糖类药物质量控制的重要内容，也是筛选提取工艺优劣的基础。苯酚-浓硫酸法原理系多糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糠醛或其衍生物，可与苯酚试剂缩合产生有色化合物，反应后溶液呈橙黄色，在波长 490 nm 及一定波度范围内有特征吸收，其吸光度与多糖含量呈线性正比关系，从而可利用分光光度计测定吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量。该法简单快速，
26、灵敏度高，便于实际应用。本研究采用精制六月青总多糖测得其对葡萄糖的换算因子，由于组成与待测物接近，从而避免了因使用葡萄糖作为标准而引起的误差。苯酚极易氧化，操作时应避光或操作迅速，试验中所用苯酚为重蒸苯酚，将苯酚与铝片、碳酸氢钠混合加热蒸馏后收集 182 的馏分，配制成相应浓度，溶液浓度不宜过高，否则影响反应稳定性，硫酸应保持较高的的纯度，同时注意操作步骤统一和反应时间一致，确保数据重现性和可靠性。参考文献1林兴,黄权芳,李江,等.广西民间药六月青的性状与显微鉴定 J.中药材,2005,28(7): 542.2刘曦,黄仁彬,孙懿,等.六月青多糖体外抗氧化作用的研究 J.中国医院药学杂志,200
27、8,28(23):1984.3Tian S, Zhou X, Gong H, et al. Orthogonal test design for optimization of the extraction of polysaccharide from Paeonia sinjiangensis K.Y. Pan J.Pharmacognosy magazine, 2011, (25):6.4Liang Renjie. Orthogonal test design for optimization of the extraction of polysaccharides from phasco
28、losoma esulenta and evaluation of its immunity activity J. Carbohydrate polymers, 2008, 73(4):560.5Li PC, Zhang BC, Chen ZG. Optimization for extraction technology of polysaccharide in root of Adenophora potaninii from Taibai mountain in China by orthogonal experimental design J.China journal of Chi
29、nese materia medica, 2008, 3(11):1266.6陈燕忠,符美燕,谢清春,等.灰兜巴粗多糖的提取及含量测定 J.中国实验方剂学杂志,2011,17(6):81.7陈韩英,廉宜君,陈韩飞,等.正交设计法优化复方党参中多糖的提取工艺 J.中国医院药学杂志,2010,30(03):104.8韩忠耀,周福军,单淇,等.正交设计法优选解毒通络颗粒提取工艺 J.中国实验方剂学杂志,2012,18(09):16.9张黎明,朱丽,李雪,等.玉屏风总多糖水提醇沉工艺条件优化 J.中国实验方剂学杂志,2011,17(1): 26.10盛小莉,王凯平,正交设计优化当归多糖提取工艺J. 中成药 ,2008,30(12):1864.
