1、毕业论文 文献综述 生物工程 微生物产麦角固醇的研究进展 摘要： 麦角固醇是一种重要的医药和农药原料，又是维生素 D2的前体。在一些真菌体内，如青霉菌、酵母菌和黑曲霉的菌丝体内含有大量的麦角固醇，而酵母菌尤为多，所以一般以培养酵母来提取。本文针对微生物发酵法产麦角固醇进行研究综述，从发酵培养基和发酵条件的优化和皂化工艺条件的影响两方面进行探讨。 关键词： 麦角固醇；优化；皂化 1 麦角固醇概述 1.1 麦角固醇的理化性质 麦角固醇 (Ergosterol)又名麦角甾醇，化学名称为 24-甲基胆固醇 -5， 7烯 -3-羟基 ，分子量为 396.66。常温下是固体，熔点为 156 158， 23
2、时旋光度为127.5（ C=1.2,氯仿）， 不溶于水，易溶于 乙醚 、石油醚、 乙醇、甲醇、正 庚烷等有机溶剂。 麦角固醇属于不饱和化合物，当遇到空气中的氧或光线时即使在常温下也能被氧化。紫外照射波长的不同会对麦角固醇光转化产生较大的影响。过度照射时还可生成超甾醇等物质 1。 1.2 麦角固醇的应用 麦角固醇可用于“可的松”、“激素黄体酮”以及“芸苔素内酯”等药物的生产，是一种重要的医药和农药原料 2。麦角固醇还是维生素 D2 的前体。 维生素D2是一种重要的药品 , 它在调节生命代谢功能上有重要作用。 麦角固醇还可以用于表征真菌生物量，它作为真菌细胞膜的重要组成物质，具有很强的专一性，为表
3、征真菌生物量提供了可能 3。 2 微生物发酵条件的优化研究 2.1 氮源 微生物种类不同时，培养基氮源对麦角固醇含量和菌体生物量影响也不同。Wenck 等的研究表明氮源及 C： N 对费希尔曲霉麦角固醇的合成影响很大。 而Eugene 等研究发现不同的氮源对酿酒酵母中麦角固醇含量影响很小，他所采用的氮源分别为 （ NH4） 2 SO4、 NaNO3、尿素及酪蛋白水解物 。国内此方面的研 究结果也不尽相同，莫湘君 4等研究得出，增大 （ NH4） 2 SO4添加量反而会使酿酒酵母产麦角固醇的量有所降低，但增加酵母生物量。有的认为添加氮源可提高红曲霉菌体生物量，而单位细胞麦角固醇含量则没有明显变化
4、 5 。谭天伟等 6研究发现，当用 （ NH4） 2 SO4 或蛋白胨做氮源时，麦角固醇含量较低，而生物量却较大；当用牛肉膏或 NaNO3做氮源时，菌体中麦角固醇含量与生物量与上相反。张博润等 7研究认为 （ NH4） 2 SO4和尿素的添加及浓度的提高，酿酒酵母细胞生物量和麦角固醇含量均明显降低，尿素的影响尤其突 出。综上所述，氮源对不同的菌株，影响也是不同的。 2.2 碳源 微生物的生长都需要消耗各种营养物质，而每种营养物质的不足或缺少都会影响微生物的生长，同时也会影响发酵代谢的途径。 Eugene 等曾用九种其 它 碳源来代替葡萄糖，发现果糖可使细胞干重有所增加，但是麦角固醇含量基本是不
5、变的。对细胞生长及麦角固醇含量综合考虑，麦芽糖是较好的碳源。 Starr 的研究 得出 ， 生物合成 甾醇与葡萄糖的浓度成正比 关系 8。 王纪等 9研究表明，当碳源不同时培养所得菌体量差异较大，当用麦芽糖作碳源时，酵母生长最好，但麦角固醇积累较少， 而蔗糖做培养基的碳源时最有利于酵母生产麦角固醇。 由此可见，对于不同的菌种来说，都有其最适的碳源。 2.3 通气条件 Maguigan 等在研究面包酵母时得出结论，麦角固醇的合成是有氧代谢的特征 10。 酵母在通气良好的条件下生长，能合成大量的麦角固醇 ，在通气不足的条件下，细胞不能合成甾醇环，从而抑制麦角固醇的合成。 Lusuk11等的研究也表
6、明有氧能促进细胞合成麦角固醇。 2.4 发酵时间 酵母细胞麦角固醇的含量与培养时间的关系受多种因素的影响。 Brejvik的研究认为酵母的细胞麦角固醇含量随培养时间的延长 而增大。然而 Eugene等的研究认为，菌种、培养基成分的不同会影响酵母细胞中发酵时间与麦角固醇含量的关系。陈松生的研究发现，菌株不同时，麦角固醇含量最大时对应培养时间也不同。研究还发现，酵母细胞中麦角固醇的含量和菌体生物量有一定程度的负相关，即麦角固醇含量高的，菌体生物量偏低，而生物量高的，麦角固醇含量又较低。因而，最佳发酵条件的确定既要考虑麦角固醇含量又要考虑菌体生物量。 2.5 pH值 酵母菌进行繁殖的环境应呈微酸性。
7、 通常在铵根离子的培养基中由于铵根离子被酵母吸收，发酵液的 pH值将随之降低， pH值的降 低将减慢酵母菌的生长速度，酸性过大甚至使菌体停止生长。 所以最适的 pH值为 4.5-5.5之间。 2.6 温度 对于一般的酿酒酵母， 50 是死亡温度，而 30 是菌体生长的最佳温度，也是酵母细胞内甾醇的最佳合成温度 12，在 4550 条件下培养时，酵母基本上会停止生长。在低温下发酵，酵母菌体量将减少，但细胞内甾醇和内脂的含量却基本保持恒定。温度更低时，菌体量和细胞内甾醇和类脂的含量都将有所下降，甚至停止生长。 3 皂化过程中各种条件的影响 3.1 乙醇用量的影响 皂化是测定麦角固醇含量的关键步骤，
8、一般在醇碱溶 液中进行，乙醇的量在皂化过程中起着重要作用。谢宗良 13对乙醇用量进行了实验。他向回流瓶中分别加入 5mL,10mL,15mL,20mL,25mL,30mL 无水乙醇，沸水浴中回流后用乙醚萃取，测定麦角固醇含量。由实验结果可知，乙醇由 5mL 增加到 15mL 时乙醚溶液中麦角固醇的含量也随之增加，当乙醇的量为 15mL以后，麦角固醇含量基本上不再增加。 3.2 氢氧化钾用量的影响 氢氧化钾的用量也对皂化起重要影响。发酵液摇匀取 100mL， 4000r/min离心 15min，弃上清液，沉淀用蒸馏水洗涤 2-3次后转入 250mL圆底回流瓶中，加入 15mL 无 水 乙 醇 溶
9、 液 ，然 后 将 回流 瓶 中分 别 加 入浓 度 为10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%的 KOH溶液 20mL，沸水浴中回流后用乙醚萃取，测定麦角固醇含量。由实验结果得知，乙醚中麦角固醇的含量随 KOH浓度增加而增加，当 KOH 的浓度达到 50%后麦角固醇的含量基本不再变化。增加KOH用量，发现在加入浓度为 50%的 KOH时，乙醚中麦角固醇含量随 KOH体积增加而增加，当 KOH用量为 20mL时麦角固醇含量达到最高。 3.3 皂化时间的影响 皂化时间影响麦角固醇提取率的高低，对发酵液 分别皂化1h,1.5h,2h,2.5h,3h,3.5h,然后测乙醚中麦角固醇含量
10、，结果发现，随着皂化时间的增加，麦角固醇含量逐渐增加，当皂化时间达到 3h后乙醚中麦角固醇的含量不再变化。 3.4 反应温度的影响 张鹏荣 14对此做过研究。他取固体发酵物 10g于圆底烧瓶中，加入 20mL的无水乙醇与 10mL的甲醇和 20mL 的浓度为 15%NaOH溶液，分别在 60 、 70 、80 、 90 、 100 的水浴加热回流 120min。得出结论，麦角固醇的提取量随温度的升高呈先增大后减小的趋势，当温度超过 90 后，提取量下降 ，这是因为皂化温度越高，越有利于细胞破壁，皂化更加彻底，但超过一定的温度后，麦角固醇会分解，提取率也就下降了。 综上所述，皂化萃取法提取麦角固
11、醇的最佳条件为： 100mL 发酵液中加入20mL50%的 KOH,15mL无水乙醇 90 水浴皂化 3小时。 4 展望 综上所述，有关麦角固醇生物合成方面的研究取得了很大进展。通过对 碳源、氮源、通气条件、发酵时间、温度、 pH 值等条件的研究 以及皂化工艺的优化可以极大程度的提高麦角固醇的产量。但由于我国维生素 D2的年需求量达 200吨，而麦角固醇作为维生素 D2的前体，年产量远不及 此。所以应该对麦角固醇发酵条件进行更深入地优化研究，以获得高产的麦角固醇菌株，并利用获得率高的提取方法进行麦角固醇的提取。此项研究具有重要的经济效益和社会效益。 参考文献 1 林琳 .麦角固醇光解生产维生素
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