1、文献翻译题 目 中国馒头生产过程中小麦谷蛋 白的聚合作用和麦谷蛋白聚合 物的变化 学生姓名 高 翔 专业班级 食品科学与工程专业 12-01 班 学 号 541203010112 院 （系） 食品与生物工程学院 指导老师（职称） 张 露（教授） 完成时间 20 年 月 日 中国馒头生产过程中小麦麦谷蛋白的聚合作用和麦谷蛋白聚合物的变化1中国馒头生产过程中小麦谷蛋白的聚合作用和麦谷蛋白聚合物的变化Xiang-Yu Wang, Xiao-Na Guo, Ke-Xue ZhuState Key Laboratory of Food Science and Technology, School of
2、Food Science and Technology, Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety,Jiangnan University, 1800 Lihu Avenue, Wuxi 214122, Jiangsu Province, PR China摘要：研究了中国馒头生产过程中谷蛋白的聚合作用和麦谷蛋白聚合物的变化，为改善和控制 CSB 质量提供理论依据。在面团的准备阶段，蛋白质的可萃取性和自由巯基（SH ）的含量会增加到一定程度，但是在通入蒸汽后会有显著降低（P0.05 ） 。同时，
3、在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）模式下，观测到大量的蛋白质聚合物。通过激光扫描共聚焦显微镜，对气泡微观结构和蛋白质网络的研究，进一步揭示了连续和三维面筋网络的形成。在面团的加工过程中，GMP 湿重的损失和恢复是至关重要的（P0.05 ） 。而麦谷蛋白的解聚作用与 GMP 湿重以及高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS ）和低分子量麦谷蛋白亚基（LMW-GS）的含量成负相关。谷蛋白的聚合作用会导致 GMP 的 G和 G减少，而谷蛋白的解聚作用诱导 GMP 的 G和 G略有增加。1 介绍中国是世界上最大的小麦生产国和消费国。中国馒头（CSB） ，也被称为中国的馒头，是一个基于小
4、麦发酵的传统中国食品，占中国小麦消费量的 40以上(Kim, Huang, Zhu, Weegels, Verhoek, De Groot, Skerritt, Hac, Lindsay, Singh, 2005)，而且一些研究人员只关注 GMP(Don, Lichtendonk, Plijter, Ong, Ross, & Engle, 2010)。在考虑到谷蛋白的聚合 /解聚和 GMP 改变面团特性以及 CSD 质量的重要性上，谷蛋白的聚合/解聚与 GMP 特性之间的关系被怀疑。据我们所知，很少文献着重于谷蛋白的聚合/解聚和 GMP 的变化之间的关系。此外，对于谷蛋白聚合和 GMP 在 C
5、SB 中如何共同决定面筋网络形成的理解是很浅显的。小麦面筋网络的形成对于许多以小麦为主的食品来说是至关重要的，例如：面包(Lagrain et al., 2007)，意大利面(Bruneel et al., 2011)，披萨饼，椒盐卷饼(Rombouts, Lagrain, Brijs, & Delcour, 2012a)，磅蛋糕 (Wilderjans, Pareyt, Goesaert, Brijs, & Delcour, 2008)和饼干 (Pareyt, Van Steertegem, Brijs, Lagrain, & Delcour, 2010)。许多产品的特点都受到了面筋网络形成
6、的影响，例如：面包的体积和筋道(Aussenac et al., 2001)，蛋糕的塌陷和面食烹饪损失(Bruneel et al., 2010)。制作 CSB 时，连续粘弹性的面筋网络在调节面团发酵和蒸制过程中的扩张起到了最重要和决定性的作用，此外，它在产品的尺寸规格和质量上也至关重要。强中国馒头生产过程中小麦麦谷蛋白的聚合作用和麦谷蛋白聚合物的变化4韧的网络包裹了酵母发酵过程中产生的二氧化碳气体，并直接有助于形成一个典型的扩张气泡和蜂窝结构(Zhu, 2014)，蒸制后，赋予典型的碎屑纹理。然而，具我们所知，谷蛋白在生产 CSB 过程中的变化信息是匮乏的。在混合、发酵、醒发和蒸制过程中，谷
7、蛋白确切的性质变化还没达到共识，在 CSB 蒸制中，对于谷蛋白基本物理化学的转换知之甚少。谷蛋白交联机制的完整认识对于控制小麦制品的最终使用质量有很大的价值。因此，本研究的目标是为了进一步深入了解小麦谷蛋白在 CSB 加工过程中的聚合行为，并调查谷蛋白聚合和 GMP特性变化之间可能的相关性。SE-HPLC 和 SDS-PAGE 分别适用于检查经受CSB 加工的每个阶段谷蛋白的聚合，并评估分子大小分布的变化。另外，自由巯基的水平，GMP 湿重， GMP 粒度分布，GMP 流变学和 GMP 亚基也被确定。此外，为了可视化蛋白质网络的形成，通过 CLSM 观察谷蛋白的每一个阶段的微观结构。这项研究的
8、目的在于丰富 CSB 生产过程中谷蛋白交联机制的认识，并为进一步研究控制 CSB 的质量提供理论依据。进一步的工作将完成探索谷蛋白聚合和 CSB 质量参数之间的关系。2 材料和方法2.1 材料小麦面粉（品牌：金龙鱼，由益海嘉里粮油工业有限公司，济宁，中国制造）来自当地市场。水分，蛋白质含量(N*5.7)和灰分含量分别为13.240.01，11.190.05和 0.420.03。新鲜，购买安琪干酵母（湖北，中国） 。在实验中使用的所有化学品、溶剂和试剂最少都要分析等级，分析至少要完成一式两份。2.2 CSB 的准备制作 CSB 的基本配方包含：面粉 400 克、蒸馏水 200 克、活性干酵母 2
9、 克。和面前，将新鲜酵母溶解在温水中(35-40)，并放置 3 分钟以便于激活酵母。把配料放入搅拌机（雷鸟，加拿大）内搅拌 4 分钟（低速 3 分钟，然后再中速1 分钟） 。然后，把面团放在 25和 55%相对湿度的环境中发酵 60 分钟。发酵后，将 40 克（在第一步骤混合中使用小麦面粉的基础上加入 10 克/100 克小麦中国馒头生产过程中小麦麦谷蛋白的聚合作用和麦谷蛋白聚合物的变化5面粉）小麦面粉和发酵面团再混合，并用低速搅拌五分钟。将混合面团分割，并以手工成型圆润的面团。然后，在 38和 85%相对湿度的环境中醒发 30 分钟。最后，将醒发过的面团在蒸笼上蒸 30 分钟。保留每个阶段面
10、团的样本（混合、发酵、混合、揉面、醒发） ，并将在蒸馒头过程中，不同时间的面团状态立即用液氮冷冻，冷冻干燥和粉碎。2.3 高效液相凝胶色谱法(SE-HPLC)蛋白质萃取和 SE-HPLC 是根据 Lagrain, Brijs, Veraverbeke,和 Delcour (2005)的方法做了一些调整。所有样品（含 1.0 毫克蛋白质）均用 1.0 毫升含有2.0（重量/体积）十二烷基硫酸钠（SDS）的一个 0.05M 磷酸钠缓冲液（PH=6.8）萃取，以下简称 SDS 缓冲液，并在室温下震荡 60 分钟。确定在还原条件下蛋白质的可萃取性，将样本用 1.0 毫升含有 2.0M 尿素和 1.0%
11、重量/体积）二硫苏糖醇(DTT)的 SDS 缓冲液来萃取，并将悬浮液以 7690 的加速度离心10 分钟，再通过一个 0.45 微米的隔膜过滤后，得到干净的上清液。把蛋白质提取物装载到一个分离范围从 15 到 500kDa (300 mm *7.8 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA)的 Biosep-SEC-S4000 柱上，并显现在一个液相色谱 (LC)系统上（日本岛津，日本京都） 。洗脱溶剂为乙腈/水（1：1，V/V ）含有0.05（体积/体积）三氟乙酸（TFA）与 1.0 毫升 /分钟的流速且柱温为 30。监测在 214nm 下蛋白质的洗脱。洗脱曲线被分
12、成三个部分，使用最低的吸光度读数之间的峰值作为截止点。第一级分相当于在 SDS 缓冲液中萃取麦谷蛋白的水平，第二级分属于 SDS-萃取麦醇溶蛋白的水平，第三级分是 SDS-萃取小麦面粉蛋白质提取物中白蛋白和球蛋白的水平。在含有中等水平的 SDS 中(SDSEP)面筋蛋白的可萃取性总是由相应的峰面积来计算，并表示为还原条件下小麦面粉峰面积的百分比，这代表了面粉用 SDS-萃取蛋白质的总量，因为降低的面筋蛋白是可以完全萃取的。2.4 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳）分析用 12分离胶（PH=8.8 ）和 5积层凝胶（PH=6.8）在垂直电泳细胞中进行蛋白质的 SDS-PAGE
13、 分析。蛋白质萃取缓冲液是 0.01M 的 Tris-盐酸（PH=6.8） ，含有 10（重量/体积）SDS，10（体积/体积）甘油和0.1（重量/体积）溴酚蓝。每个样品 60 毫克，边加入样品边搅拌于 1.0 毫升中国馒头生产过程中小麦麦谷蛋白的聚合作用和麦谷蛋白聚合物的变化6提取缓冲液 10 分钟并在室温下放置 1 小时。为了减少蛋白质，提取缓冲液含有5（V/V）2-巯基乙醇（2-ME） 。将样品在 100 下加热 5 分钟后，以 7690加速度离心 10 分钟。在每个泳道上放置体积为 10 微升的样品，且在电泳运行期间以 100V 的恒定电压进行。然后，将凝胶用 0.25（重量/体积）考
14、马斯亮蓝 R-250 染色，并用 7（体积/体积）乙酸滴定至褪色。2.5 自由巯基含量的测定样品中巯基含量的测定方法是根据 Rombouts, Jansens, Lagrain, Delcour, and Zhu (2014)所报道的方法进行了一些调整。把 0.200g 样品首先悬浮在 5.0 毫升含有 2.0（重量/体积）SDS ，3.0M 的尿素和 1.0 毫摩尔 /升乙二胺四乙酸四钠的 0.05 摩尔/升的磷酸钠缓冲液（样品缓冲液，PH=6.5）中，将混合物震荡 60分钟。然后，再加入 500 微升 5,5-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB)试剂（0.1w/v的样品缓冲液） ，并将悬浮液在
15、黑暗中略微震荡 10 分钟。接着，将悬浮液以11000 加速度离心 10 分钟。等到完全加入 DTNB 试剂 45 分钟后，将上清液的吸光度在 412nm 空白处测定（不含 DTNB 试剂或样品） 。吸光度值用还原性谷胱甘肽的校准曲线转化为自由巯基(1mol/gdm 蛋白质)的水平。2.6 激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）CLSM 是一种能够更深层次的了解 CSB 内面筋蛋白网络的微观结构和三维结构的有价值的方法，由于它在食品体系内有选择和区分特定结构的能力(Drrenberger, Handschin, Conde-Petit, & Escher, 2001)，因此被应用于染色程序。从 CS
16、B 的中间部分取馒头片 (0.5*0.5*0.2 cm)，浸入 2.5戊二醛的定影液后，放入 0.1M 磷酸盐缓冲液(PH=7.0) 中 24 小时，并用 CLSM 制造商推荐的脱水乙醇（型号 LSM710，德国莱卡） 。部分馒头片在旋转切割机(PM2245, 莱卡)上用钢刀被消减为 10 微米厚之后，再转移到载玻片上。分别将异硫氰酸荧光素(FITC, 3.5*10-4 g/ml)和罗丹明 B (1.3*10-5 g/ml)的溶液用于非共价标记的淀粉（绿色）和蛋白质（红色） 。获得了一个像素分辨率为 1024*1024 的 CLSM 图像后，使用 ZEN2012 软件来分析确定面团和 CSB
17、样品的微观结构。FITC 和罗丹明 B 的吸收光谱分别为 488nm 和 561nm。中国馒头生产过程中小麦麦谷蛋白的聚合作用和麦谷蛋白聚合物的变化72.7 GMP 的分离GMP 的分离是根据 Don 等人(2003a, 2003b)描述的方法进行了一些调整。将质量为 1.4 克的面粉悬浮于 28 毫升 1.5（重量/体积）SDS，并在 4下以20000 加速度离心 20 分钟。倒出上清液，并在淀粉顶部的凝胶层收集 GMP，将其立即称重作为 GMP 的湿重。取 CSB 制作不同阶段的冻干面团进行 GMP分离作为面粉描述。在蒸 CSB 过程中，GMP 以凝胶的形式分离导致蒸出的馒头品质不好。其原
18、因可能是在蒸馒头的过程中，麦醇溶蛋白通过一个 SH/SS 交换反应并入麦谷蛋白中，并导致形成了一个永久的面筋网络。因此，由于在CSB 中麦谷蛋白和麦醇溶蛋白之间的交联，面筋网络的流动性降低，麦谷蛋白组分不能被分离出凝胶层。此外，嵌入式淀粉的糊化降低了 GMP 凝胶分离的可能性。表 1：在含有十二烷基硫酸钠的缓冲液中萃取蛋白数据表示为平均值标准偏差（n=2） 。在同一列中的不同小写字母表示显着差异为 P0.05。蛋白质在SDS 中的可萃取性（）总是由相应的峰面积计算，并表示为还原条件下小麦面粉的峰面积的百分比， ，由于减少的谷蛋白是完全萃取，该百分比代表 SDS-萃取面粉中蛋白质的总值。2.8
19、GMP 的粒度分析将新鲜制备湿的 GMP（1 克）样品分散在 10 毫升 1.5（重量/体积）SDS上，轻轻旋转得到 GMP 的分散体，使其呈现出目视均匀和乳光。GMP 分散体的粒度分布通过范围为 0.1-1000 微米的激光粒度（S3500，Microtrac Inc.公司，美国）来确定。2.9 GMP 凝胶的流变学GMP 凝胶的流变学是根据 Don 等人(2003a, 2003b)的方法来进行测定的。从凝胶的顶部小心的取出 GMP（1 克） ，并在旋转流变仪（AR-G2，TA 仪器）的平行板（平行板直径 20 毫米）上进行分析。测量是在 20，0.03-10 赫兹的中国馒头生产过程中小麦麦
20、谷蛋白的聚合作用和麦谷蛋白聚合物的变化8频率扫描模式，线性粘弹性范围内以 0.5的固定应变下进行，通过动态应变扫描测量确定。2.10 统计分析在研究中所得到的所有数据均表示为至少两个重复测定的平均值。方差分析（ANOVA）是使用 SPSS16.0（SPSS 公司，芝加哥，IL，美国）软件进行单项方差分析（ANOVA）和 Duncan 的多重范围测试。 P 0.05 是用来定义采样之间的差值显著性。3 结果与讨论3.1 面筋蛋白的可萃取性在含有介质的 SDS 中，蛋白质的可萃取性是交联程度的良好指示(Hayta & Schofield, 2004)。如表 1 所示，面筋蛋白的可萃取性，在 CSB
21、 加工过程中，2%的 SDS 中的麦谷蛋白和麦醇溶蛋白差异十分显著。与小麦面粉相比，蛋白质混合后的可萃取性略有下降，这与 Jazaeri 等人(2015)的研究相符合。相比之下，Lagrain 等人(2007)观察到面包面团在混合过程中蛋白质的可萃取性增加。其原因可能是，额外的盐诱导面筋蛋白(Fu, Sapirstein, & Bushuk, 1996)通过非共价相互作用发生解聚。麦醇溶蛋白的可萃取性降低表明，在面团混合过程中，部分麦醇溶蛋白通过疏水相互作用与麦谷蛋白相互联系。然而，由于增加了蛋白质的流动性，并通过水合作用改变了结构，SDS 可萃取的蛋白质水平有显著的增加且高于小麦面粉混合时的
22、值。观察到在发酵过程中谷蛋白和麦谷蛋白的可萃取性略有增加。再次混合和混合期间，由于机械能的输入使蛋白质的可萃取性有定性增加，可萃取的蛋白质和麦谷蛋白的数量在面团醒发时又再次减少，验证假设麦谷蛋白聚合物发生再聚合。总的来说，SDS 可萃取蛋白质的改变，表明在面团加工中较少的发生解聚作用，从而保持更好的弹性以应对蒸制馒头时淀粉的膨胀(Bruneel et al., 2010)。许多科学家已经研究了面筋蛋白承受相对较高温度的性能(Deng, Tian, Zhao, Zhang, & Sun, 2008)。小麦面筋蛋白的热处理导致二硫键通过 SH-SS 交换反应和自由巯基的氧化后交联，从而导致大的蛋白
23、质聚集物的形成及相应的流变和功能的变化(Lagrain et al., 2005)。表 1 显示，在蒸馒头时面筋蛋白的可萃取性有显中国馒头生产过程中小麦麦谷蛋白的聚合作用和麦谷蛋白聚合物的变化9著的降低(P0.05)，表明了蛋白质的聚集和密集面筋网络的形成，这是由于增加了巯基（SH）-二硫键（SS ）的交换反应。蒸制对谷蛋白的可萃取性有很大的影响，且麦谷蛋白比麦醇溶蛋白更容易受到热处理。在蒸制的前十分钟内，大部分麦谷蛋白变为不溶性，且可萃取性显著降低 95%以上，然后，即使在更长的蒸制时间内保持不变（表 1） 。蒸制 10 分钟麦醇溶蛋白的可萃取性减少43.9%，而蒸制 20 分钟导致麦醇溶蛋
24、白的可萃取性减少 75.6%（表 1） 。蒸制 10分钟与蒸制 5 分钟相比，可萃取的麦醇溶蛋白大幅度减少了 16.45%，这表明大量的麦醇溶蛋白通过 SH-SS 交换机制并入了麦谷蛋白。麦谷蛋白具有热敏感性，可以优先通过氧化自由巯基成为 SS 产生聚合，且部分与麦醇溶蛋白发生结合。蒸制 10 分钟后，麦谷蛋白的聚合主要归因于 / 型麦醇溶蛋白与麦谷蛋白的相互作用，除了缺乏半胱氨酸残基的 -麦醇溶蛋白(Deng et al., 2008)。蒸制时间 25 分钟，麦谷蛋白的可萃取性略有增加（表 1） 。一种解释可能是二硫键（SS）的裂解和麦谷蛋白聚合物通过 SH-SS 交换重排。总之，谷蛋白的聚
25、合主要发生再蒸制的过程，并且蛋白网络更易于跟随淀粉膨胀。3.2 谷蛋白的电泳概要分析为了评估谷蛋白分子大小分布的变化，进行非还原的 SDS-PAGE。图 1 所示，当蒸制 5 分钟和 10 分钟时，高分子量麦谷蛋白(90124 KD) (Marchetti, Cards, Campaa, & Ferrero, 2012)对应的分离凝胶顶部的谱带强度明显减少，与表 1 所示 SDS 萃取蛋白质的显著减少相对应。这与早期报道(Don et al., 2006)显示特定的高分子量麦谷蛋白亚基和产品性能的相关性一致。蒸制时间越长，分离凝胶顶部的谱带将消失，表明有较大尺寸的蛋白质聚合物的形成，且在非还原
26、条件下无法进入凝胶。对于较低的分子量范围，/-麦醇溶蛋白(2840 KD)、-麦醇溶蛋白(3842KD) 和低分子量麦谷蛋白(LMW-glutenins, 3644 KD) 相对应的谱带强度在蒸制时间内逐渐减少，这与麦醇溶蛋白和麦谷蛋白在 SDS 中可萃取性的变化相一致。在蛋白质中，观测到 -麦醇溶蛋白(5579 KD)的范围没有显著变化，这表明缺乏巯基基团，因此无法通过二硫键聚合。低分子量亚基的范围多达 20KD，也被观测到在蒸制时蛋白质带的强度有显著减少，表明白蛋白和球蛋白广泛参与到蛋白质网络。综上所述，在这项研究中，冷冻干燥面团的电泳模式在蒸制之前没有显示出任何明显变化。在蒸制时，谱带强度多种多样。
