1、河北大学期末论文题目： 生物制药课程论文 姓 名 王明望 学 号 20144145073 年级专业 2014 级药学类 指导教师 李宝库 2016 年 12 月 31 日植物生物反应器技术的现状与前景【摘要】：利用植物生物反应器生产外源蛋白是一个有吸引力的廉价生产系统, 以下介绍了植物生物反应器的不同表达系统, 及其各个系统的发展进程和研究现状等。重点论述了应用植物各大表达系统生产疫苗、抗体和医用蛋白等方面的情况以及本实验室在这一领域的研究情况。随着该领域研究的进展,植物生物反应器用于生产低成本药用蛋白的产业化将显示出越来越良好的发展前景。【关键词】：植物生物反应器技术 应用 发展 前景 利用
2、植物生物反应器生产外源蛋白是一个有吸引力的廉价生产系统，以下介绍了植物生物反应器的不同表达系统,及其各个系统的发展进程和研究现状等。重点论述了应用植物各大表达系统生产疫苗、抗体和医用蛋白等方面的情况以及本实验室在这一领域的研究情况。随着该领域研究的进展,植物生物反应器用于生产低成本药用蛋白的产业化将显示出越来越良好的发展前景。随着基因工程、细胞工程、酶工程的发展,生物技术不断影响着人类生活的方方面面, 不仅体现出巨大的经济价值,也提供了不可替代的社会服务。其中, 利用植物生物反应器表达生产具有临床应用价值的药用蛋白(包括疫苗、抗体)已成为生物制药产业的热点领域, 在抢占生物经济制高点、促进国民
3、经济持续稳定发展进程中显示了越来越重要的作用,具有极大的市场前景和商业价值,日益引起人们的关注。1 植物生物反应器简介生物反应器是指利用生物系统大规模生产有重要商业价值的外源蛋白, 用于医疗保健和科学研究2。1982 年首次成功地利用细菌生产重组胰岛素,这一突破消除了大规模应用胰岛素的限制因素,但依赖微生物发酵和哺乳动物培养生产商业蛋白体系成本高、规模化生产困难,安全性较差3。随着 DNA重组技术和植物组织培养技术的快速发展,世界第一例转基因植物在 1983年成功诞生于美国的华盛顿大学。1989 年哺乳动物抗体在转基因植物中首次成功表达,证实了植物作为生物反应器的可行性。此后, 植物生物反应器
4、研究逐渐兴起。2植物作为生物反应器的优势: （1) 植物生产外源蛋白成本低,只需阳光、土壤、水分和肥料, 而微生物发酵和动物细胞培养则需要昂贵的培养基, 并且工业化大规模生产时需要严格控制培养条件,增加生产成本。（2) 植物细胞能够再生成植物,易于成活、生长周期短、易于快速筛选转基因阳性植物、比构建动物生物反应器省时、成功率更高。（3) 转基因植物通过自交得到的后代遗传性状稳定,从而可以在植物体内积累多基因4。（4) 植物可大规模种植,产物贮藏在种子、果实、块茎中, 易于保存、运输, 其中那些能直接食用的植物疫苗不需特殊贮存条件。（5) 植物生物反应器能正确地表达、组装复杂的蛋白质, 生产的蛋
5、白活性高,很多复杂的蛋白质在微生物系统中不能正确地翻译、折叠、聚合, 最终被降解或形成没有活性的包涵体, 而植物具有生产任何复杂蛋白的潜能性。（6) 植物生物反应器生产外源蛋白更安全, 植物体只表达部分免疫蛋白, 不含致病微生物, 没有其他病原菌污染8。3植物生物反应器的类型及其特点植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、易团聚等特点。同时，植物细胞规模培养的目的是生产天然产物，而这些天然产物均为细胞此生代谢物。所以，植物细胞培养反应器的设计，不仅要考虑有利于细胞生长，同时还要考虑有利于产物的积累和分离。总体上讲，适合植物细胞的反应器应该具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。根据不同
6、植物细胞生长和代谢产物积累的特点，目前已研究设计出多种类型的反应器用于植物细胞培养。 反应器的选择取决于生产细胞的浓度、通气量以及所提供的营养成分的分散程度。根据通气和搅拌系统的类型可将生物反应器分为以下几类： 1 机械搅拌式生物反应器 机械搅拌式生物反应器有较大的操作范围，混合程度高，适应性广，在大规模生产中广泛使用。搅拌罐中产生的剪切力大，容易损伤细胞，直接影响细胞的生长和代谢，特别对于次级产物生成影响极大。搅拌转速越高，产生剪切力越大，对植物细胞伤害越大。对于有些对剪切力敏感的细胞，传统的机械搅拌罐不适用。为此，对搅拌罐进行了改进，包括改变搅拌形式、叶轮结构与类型、空气分布器等，力求减少
7、产生的剪切力，同时满足供氧与混合的要求。2 非搅拌式生物反应器 相对于传统搅拌式反应器，非搅拌式反应器所产生的剪切力较小，结构简单，因此被认为适合植物细胞培养，其主要类型有鼓泡式反应器、气升式反应器和转鼓式反应器等。 通过对培养紫苏细胞的生物反应器比较发现鼓泡式反应器优于机械搅拌式反应器。但由于鼓泡式反应器对氧的利用率较低，如果用较大通气量，则产生的剪切力会损伤细胞。研究表明，喷大气泡时，湍流剪切力是抑制细胞生长和损害细胞的重要原因。较大气泡或较高气速导致较高剪切力，从而对植物细胞有害。气升式反应器广泛应用于植物细胞培养的研究和生产。通过胡萝卜细胞培养研究发现，比较搅拌罐、气体喷射罐和带通气管
8、的气升式反应器，最高细胞浓度和最短倍增时间可从气升罐中得到。气升式反应器用于多种植物细胞悬浮培养或固定化细胞培养，但其操作弹性较小，低气速时，尤其 H/D大，高密度培养时，混合性能欠佳。过量供气，过高的氧浓度反而会影响细胞的生长和次生代谢产物的合成。将气升式发酵罐与慢速搅拌结合使用可弥补低气速时混合性差的弱点，采用分段的气升管，也有利于氧的利用与混合。转鼓式反应器用于烟草细胞悬浮培养的研究发现，与有一个通风管的气升式反应器相比，相同条件下转鼓式反应器中生长速率高，其氧的传递及剪切力对细胞的伤害水平方面均优于气升式反应器。 3 光生物反应器 许多植物细胞培养过程中需要光照，往往考虑在普通反应器基
9、础上增加光照系统，但在实际中存在很多问题，如光源的安装、保护，光的传递，还有光照系统对反应器供气、混合的影响等。小规模实验往往采用外部光照，反应器表面有透明的照明区，光源固定在反应器外部周围。但大规模生产时透光窗的设置，内部培养物对光的均匀接受等问题难以解决，因此许多人对采用内部光源的反应器进行了研究。4 其他新型反应器 根据植物细胞的特性，许多有别于传统微生物反应器的新型反应器正用于植物细胞的研究生产，如各种固定化植物细胞反应器和膜反应器等。用新型环回式流化床反应器进行培养，测定生长和产物合成的动力学参数，结果显示该反应器操作方便，消除了气体直接喷射引起的剪切力，易于测定放大所需的参数，适合
10、中试和工业化生产。4植物生物反应器研究现状1、植物生物反应器平台利用 DNA重组技术在植物系统中表达目标生物活性分子植物生物反应器研究仅有近 2年历史;植物系统安全、低成本和易规模化优势使之成为目前重组蛋白生产主要系统之一 7。植物主流表达系统有 3种: 稳定核基因组转化、稳定叶绿体基因组转化和病毒瞬时转化 4, 7,三者各有优势, 均有不足。核基因组转化可以稳定遗传和具有较高级蛋白加工和修饰系统, 不过外源蛋白表达水平低;叶绿体基因组转化可以实现外源蛋白高效表达、稳定遗传 (胞质 )和转基因花粉无逃逸风险,但无法完成复杂蛋白加工修饰,与原核生物类似;病毒瞬时转化,操作程序简单,也可以实现外源
11、蛋白高效表达,但不能稳定遗传。许多植物平台如：单子叶 (玉米、大麦、小麦和水稻)、双子叶 (拟南芥、胡萝卜、羽扇豆、烟草、番茄、紫花苜蓿、生菜、大豆和马铃薯)、水生植物、藻类和苔藓已成功表达重组蛋白。2、 植物生物反应器产品植物系统表达包括激素、细胞分裂素、抗体和疫苗等人类治疗和检测蛋白具有潜力,在表达工业酶类如：农业食品工艺、清洁剂产品、生物修复、生物传感器、石油、造纸等也具有优势。目前用植物系统已成功表达数以百计重组蛋白,并有逐年增加趋势。在美国和加拿大,植物系统生产药用蛋白田间实验超过 370次,有 16个植物源药品进入临床实验 6。随后利用植物表达分泌抗体、抗体片段和免疫复合物数量不断
12、增加, 现已有 5个单克隆抗体在进行临床评价、2 个进入 II期临床 8。 2006年,古巴哈瓦那遗传工程和生物技术研究中心成功研制了乙型肝炎表面抗原抗体, 这是第一个被批准规模化生产的植物抗体。1992 年,第一例植物疫苗乙肝表面抗原在转基因烟草中成功表达 10。植物疫苗研究一直致力于在植物可食用组织或器官靶向表达抗原的口服疫苗 11,特别是针对病原菌单一蛋白 (抗原)或单一肽 (抗原决定基 )的植物重组亚基疫苗 7。2006 年,美国农业部批准了第一个植物源兽用疫苗鸡新城疫病毒疫苗, 开辟了植物源兽用和人用疫苗新时代 12。针对生物武器、天花、炭疽热、登革热和禽流感病毒 A 15等突发事件
13、或卷土重来重大疾病植物疫苗也是目前研究热点。植物生物反应器生产其他用途重组蛋白也具有优势和潜在应用前景,如表达甜味蛋白 18和锰过氧化物酶 19。用玉米表达的抗生物素 10和牛胰蛋白酶 41 和乳铁传递蛋白 12最近推向市场。植物表达重组蛋白显现出其巨大潜,不过受系统固有缺陷 (表达量和蛋白修饰)和科学技术(蛋白分离纯化力和优势)限制,目前尚未开发出一种可以满足人们全部需求 (理想 )的植物平台。 总体而言,植物源医药制品仍然处于临床前研究和标准制定阶段,尚没有应用于人类临床 13。5我国植物生物反应器研究展望我国对现代植物生物反应器的研究时间虽短,但是发展迅速,部分已达到国际先进水平。如 2
14、0世纪 90年代初 ,我国开始用番茄或马铃薯表达乙肝疫苗的研究,目前已经获得成功 1 。现在我国已经构建起了包括载体、遗传转化、外源蛋白高效表达策略、高效分子检测和初步下游加工技术等在内的全套较完善的植物生物反应器技术平台,成功表达凝血因子、胸腺素 19、植酸酶和 A组轮状病毒 VP6疫苗 11 - 12;利用植物表达胰岛素、生长因子、动物重组疫苗、肿瘤靶向单链抗体和口服疫苗研制正在进行中,近年有望取得重大进步 。尽管我国在构建高效植物表达载体和培育转基因植物等主要技术环节上与国外相差无几,但在基础理论、自主知识产权和综合技术平台等环节与发达国家相比却存在很大差距。因此,我国植物生物反应器领域
15、的研究需要加强基础和原创性研究,同时还需要政府资金及政策的大力支持。我国“九五 ”、 “十五 ”计划、 “863”专项计划中,与转基因植物生物反应器相关的项目很多,也取得了很大成绩。例如用 T MV载体大量表达与 TMV外壳蛋白融合的多个口蹄疫病毒表面抗原小肽,获得了表达乙肝病毒包膜蛋白的马铃薯和番茄基因工程植株 ,并开始进入环境释放阶段,以及用植物生物反应器表达降钙素和人乳铁蛋白等功能蛋白等。另一方面 ,我国植物生物反应器的研究和利用还主要集中在药用蛋白方面, 而利用转基因植物生产特殊饱和或不饱和脂肪酸、改性淀粉、环糊精或糖醇、次生代谢产物、工农业用酶制剂等产品的研究还没有引起国家足够的重视
16、,这些生物制剂的市场潜力也是非常可观的。这些方面的研究目前主要靠一些研究者和投资者自筹资金或采用国际合作方式开展,并取得了令人瞩目的研究进展,如 2007 年中国农业科学院范六云院士领导课题组成功利用转基因玉米生产出高活性植酸酶 ,相比第 1代利用微生物发酵生产植酸酶的技术有很大优势。植酸酶加工成动物饲料添加剂,可以把玉米等饲料原料中大量存在的植酸磷分解成无机磷 , 因而可有效降低家畜排泄物中的磷含量 ,在降低水污染和保护生态环境方面有重要作用。国家应从宏观方面加强植物生物反应器的研究与产业化步伐,根据市场对当前和长远产品需求,进行合理布局,有选择地重点突破。要重点资助发展拥有自主知识产权的生
17、物物质基因及生产技术 ,从研究方面要发掘更多有价值的基因 ,并为它们构建合理、高产、有市场前景的转基因生物反应器 ,建立高效表达的技术平台及转基因载体系统;从生产应用方面要重视多种有价值的产品,还要考虑在如何提高产量的同时降低成本、如何纯化所需生物活性产物、如何提高商业化程度以大范围推广等问题;还特别要注意的是,作为转基因植物,研究和生产时必须密切注意生物安全性评价与管理,避免转基因植物对生态环境造成不利影响。结语：综上所述,植物生物反应器技术在过去的几十年已取得了飞速的发展,但真正应用于商业化生产尚不成熟,依旧面临着诸多问题与挑战，相关领域的科研及工作人员仍然有许许多多的问题要去解决与处理。
18、在接下来的发现与发展过程中仍然需要我们矢志不渝的去探索创新，不断发现和解决问题，只有这样才能让我们发展更快。相信随着人类对相关领域的研究的深入以及研究技术的积累，将来会有更多植物源药物进入市场，造福人类。参考文献1 Hang Y, Zhao DX, Li ZH. The research progress of plantcell bioreactor culture (I). Plant J, 2001, 18(5): 567-570.黄艳, 赵德修, 李佐虎. 植物细胞生物反应器培养的研究进展(I). 植物学报, 2001, 18(5): 567-570.2 Franken E, Teus
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