1、 探究人唾液淀粉酶的最适 PH （碘 -淀粉比色法） 欧奇灿 学号： 201680075 临床医学 “ 5+3” 2 班 3 组 摘要： 唾液淀粉酶是由 唾液腺 分泌的一种水解酶， 可 作用于可溶性淀粉、 直链淀粉 、糖原等 -1,4-葡聚糖 等， 属于 -淀粉酶的一种。 酶学与医学联系紧密，测定酶的最适 pH， 有利于我们把酶学知识运用于临床诊断与应用治疗。本实验 尝试用碘 -淀粉比色法 测定 唾液淀粉 酶最适 pH， 加深对酶学知识的理解。 关键词： 缓冲液；唾液淀粉酶； 分光光度计 前言： 人体内各种代谢反应，都离不开酶的催化作用，酶量的改变 以及 酶活性的改变都会引起人体化学反应的异常
2、或紊乱 ，因此 酶在人体内是否能发挥正常活性关系着人体内环境的稳定。 而 pH 是影响酶活性的一个重要因素，因此，通过探究实验探究人唾液淀粉酶的最适 pH，不仅可以检测我们的生物化学实验操作能力和探究能力，也可以加深我们对 酶 学知识的理解。 正文 : 【实验原理】 酶是具有高效催化能力的生物大分子物质，其化学结构上具有许多极性基团，在不同酸碱环境中，这些基团的解离状态不同，所带电荷也不同。只有当酶处于一定的解离状态，才能和作用物结合。因此，溶液的 pH 对酶活性影响很大。若其他条件不变 ，酶只有在一定的 pH 范围内才能表现出催化活性。在某 pH 时，酶催化活性最大，此 pH 称为酶作用的最
3、适 pH。当溶液的 pH 偏离最适 pH 时，酶活性降低，甚至失活。 淀粉经唾液中淀粉酶的水解，生成糊精和麦芽糖。在底物过量的条件下，反应后加入碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其颜色深浅与空白管颜色的差值和唾液淀粉酶的活力成正比。 在底物过量的条件下，相同时间内，在温度、酶浓度相同、 pH不同的条件下，越接近最适 pH 的反应体系中酶活性越高，消耗淀粉的量越大，剩余淀粉与过量碘液生成的颜色越浅，吸光度越小。本实验利用分光光度计测出各管的吸光度后，取处于降低与升高趋势之间的较小吸光度范围对应的 pH 值即为唾液淀粉酶的最适 pH。 【仪器与试剂】 仪器材料 ：试管架 ，试管，烧杯，一次性
4、纸杯，移液枪， 刻度吸管，洗耳球，胶头滴管， pH 试纸 ， 恒温水浴箱，分光光度计 试剂药品： 2.5g/L 淀粉溶液，碘液， 0.2mol/L NaH2PO4、 0.2mol/LNa2HPO4，唾液，纯净水 【 实验步骤 】 1、唾液的获取 纯净水先漱口 1 2 次，然后含一大口水约 2 分钟，其间做咀嚼运动，然后将水和唾液一同收集至烧杯中。 【 1】 2、不同 pH 缓冲液的配制 【 2】 取 8 支试管，编号 ，按表 1-1 操作，再加蒸馏水至 10mL。用 pH 试纸检测各缓冲液pH。 （ pH7.0 的缓冲液配制 2 次 ） 表 1-1 不同 pH 缓冲液配制 （ 用量： ml）
5、试管 1 2 3 4 5 6 7 8 9pH 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 0.2mol/L Na2HPO4 0.400 0.615 0.925 1.325 1.875 2.450 3.050 3.600 4.050 0.2mol/L NaH2PO4 4.600 4.385 4.075 3.675 3.125 2.550 1.950 1.400 0.950 H2O 5.0 3、淀粉用量的确定 取 5 支试管，按表 1-2 淀粉用量进行配制，之后比较选出适当颜色深浅的那支试管。 【 3】 表 1-2 淀粉用量的确定 (用量： ml) 试管 1 2 3 4
6、 5 pH 7.0 缓冲液 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 2.5g/L 淀粉液 0.05 0.1 0.2 0.3 - 稀释 10 倍唾液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 混匀， 37 水浴 5min 后每管加 2 滴碘液 H2O 2.95 2.9 2.8 2.7 3.0 混匀，观察现象，选颜色适中一支，并记录淀粉用量 实验结果： 加碘液后加水， 1 号试管（ -）颜色淡紫近无色， 2 号试管 （ +） 颜色 淡蓝色 适中， 3、 4 试管（ +）蓝色较 2 号深， 5 号淡黄近无色（ -）。即 确定 2.5g/L 淀粉用量 0.1g。 4、酶液稀释倍数确定 【 4】 取 4
7、支试管，按表 1-3 进行配制。 表 1-3 酶液稀释用量 （ 用量： ml） 试管 1 2 3 4 稀释倍数 酶液 H2O 5 1.0 4.0 10 0.5 4.5 15 0.4 4.6 20 0.25 4.75 再取 5 支试管，按表 1-4 进行配制。 表 1-4 酶液稀释倍数确定 （ 用量： ml） 试管 1 2 3 4 5 稀释倍数 5 10 15 20 空白 酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 pH 7.0 缓冲液 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 2.5g/L 淀粉 0.1 （ 由步骤 3 确定） 混匀， 37 水浴 5min 后每管加 2 滴碘液 H2O 3 3
8、 3 3 3 混匀，观察现象，选适中一支，并记录稀释倍数 【 5】 实验结果： 1（近）、 2（ +）、 3（ +）、 4（ +）、 5（ +） 号试管 蓝色 颜色 依次逐渐加深， 2 号淡蓝色 适中，即确定酶液稀释倍数为稀释10 倍。 5. 最适 pH 的确定 取 9 支试管，取步骤 2 的 1-9 管的缓冲液，根据表 1-5进行配制。 表 1-5 最适 pH 的确定 （ 用量： ml） 试管 1 2 3 4 5 6 7 8 9 pH 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 pH 缓冲液 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9
9、2.5g/L 淀粉 0.1（由步骤 3 确定） 某稀释倍数酶液 （步骤 4 确定） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 混匀， 37 水浴 5min 后每管加 2 滴碘液 H2O 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，用蒸馏水调零测定 A660 吸光度 A660 0.183 0.212 0.359 0.323 0.238 0.206 0.192 0.262 0.263 用肉眼观察时，也能观察出 1、 2、 5、 6 这几支试管颜色明显比其他的浅，而且接近浅紫色而非浅蓝色，可能是淀粉已经被水解较多引起淀粉不足而显示浅紫色
10、。 6、 数据记录和整理 以 A660为纵坐标 ， pH 为横坐标作图，找出唾液淀粉酶的最适 pH 值 【 6】 。 【 实验注意事项 】 【 1】 唾液的获取在 适宜时间后将纯净水和唾液一同放置于事先准备好的烧杯中即可，在实验过程中应注意酶的失活，为了防止此现象发生，如有条件可将此液体置于冰水中冷却。 【 2】 本实验中准确配制相关溶液非常重要，溶液配制出错会极大的影响实验结果，为了避免这种情况，可采取小组明确分工，采用精细仪器，提高实验操作能力等手段。 【 3】 如果 底物 太少 ，与碘液几乎无现象， 不能判断实验结果 ； 如果底物过多， 碘 的颜色太深， 又 会掩盖实验反映出来的现象，所
11、以要取浓度适中的底物浓度。 【 4】 本实验中测定酶的稀释倍数，是为了找出 酶的 最适稀释倍数 ， 在该 状态 下，酶 催化 的作用最好， 实验现象相对明显， 有利于实验结果的测定 。 【 5】在确定最适稀释倍数时，若所有试管颜色都是蓝色或黄色或颜色梯度不明显，可以适当扩大或减少稀释倍数重新选取。 【 6】 若绘图时出现了数据偏差较大的点，要 综合分析原因，并予以取舍，原则上绘图应不少于 5 个点 。 【实验结果 与结论 】 以 A660为纵坐标 ， pH 为横坐标作图， 如下 ： 实验结论： 根据实验图像， 处于 大多数实验数据 降低与升高趋势之间的较小吸光度 对应的 pH 为 7.0。 因
12、此 本实验人 唾液淀粉酶的最适pH 为 7.0， 在 正常的 唾液淀粉 酶活性范围。 值得说明的是， 第 1 组 pH 为 5.8 缓冲液相对应的吸光度值 0.183 在整个实验中已经严重偏离正常值，实验误差可能较大，比如 pH为 5.8 的缓冲液配制出错或者 pH 不准 (用 pH试纸粗测缓冲液 pH 时 pH 为 6.4 7.2 的缓冲液的 pH 比较准确，其他试管的 pH 偏差较大可以支持这个分析），也有可能是加碘液的时候该试管加的碘液相对少了如粘在试管壁没和溶液混合或者加碘液的时候每一滴的量不一致。因此，第 1 组数据作为逸出值处理，不在绘图中出现。 至于结果所得的图不是预料的标准 形
13、 图 ，在保证 pH 为 7.0 是最适 pH 这个前提下，误差数据就出现 1、 2 两组，结合 上述分析，极有可能是出现了操作误差甚至错误，但是当时回忆相关操作时并没有想到哪里出了问题，所以无法定论。 【实验误差分析】 1、 不同 pH缓冲液的配制 时每种缓冲液的 pH可能不严格对应，给最终结果带来较大的误差。在我们实验过程中，因移液枪不够，所以配制缓冲液要多次移液， 用 pH 试纸粗测缓冲液 pH时 pH 为 6.4 7.2 这几支两种母液配比合适的缓冲液的 pH 比较准确，其他试管的 pH 都有一定偏差。 2、 进行淀粉用量和酶稀释倍数确定实验时，水浴加热后再加碘液后，有些试管颜色肉眼难
14、以分辨，加水稀释后如果加水过多又会稀释过度，因此带来 了颜色判断上的困难，从而带来实验误差。在本实验中，发现原来设定加水稀释时的水的量就过多，从而导致了稀释过度，后来临时改了水的用量，颜色对比才比较明显。 3、 本实验没有进行最适反应时间的探索，也可能给实验带来一定的系统误差。同时， 由于滴加试剂的先后顺序不同，导致各个试管的加热时间和酶促反应时间可能存在些许差别 。 4、 本实验是小组合作实验，多人共同操作，由于不同同学的操作习惯、实验素养不一，加上关键仪器移液枪数量有限，可能存在一定的“混乱”，如漏加、多加、少加某些试剂，或者 在滴加溶液时不慎把溶液滴在试管壁上 ， 在配置不同 pH 缓冲
15、液和测定唾液淀粉酶最适 pH中加入试剂时未混匀， 都会 造成一定影响 。 5、 不同人群的唾液淀粉酶存在个人差异，最适 pH 也相应地存在一定差异 。而且本实验时间较长，酶活性可能会有变化，因此每一步的酶活性可能会有所区别，影响结果。 结语： 正如实验指导老师所言，探究实验重在实验过程中的发现问题和解决问题，能出结果最好，不能也不是非常要紧。我们小组本次探究实验中勉强可以得出结果，但是更重要的是从这次实验中对“实验”有了更多理解。 实践是检验真理的唯一标准，实验则是验证理论的重要途径，近现代很多重要理论都是通过实 验去推翻或者证明的。 作为医学生，我们少不了“实验”，因此对我们的实验操作能力、反思总结能力都提出了很高的要求。而实验素养靠积累，在每一次实验中都能有所收获有所感悟，都能发现问题、解决问题，进而全面提升我们学生的实验能力和实验素养，为以后的进一步学习打下基础，或许是本探究实验的另一个重要目的。 参 考 文 献 1吴耀生 .医学生物化学与分子生物学实验指南 .人民卫生出版社 .2007 年 . 2查锡良，周春燕 .生物化学 .第 8 版 .人民卫生出版社 .
