1、高级生物化学实验报告实验一 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定一、原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（O 2-）的金属酶，它具有抗衰老。抗辐射、抗炎抗癌等作用，因而在医药、化妆品、食品工业等方面具有了广泛的应用前景。SOD 是一种酸性蛋白，对热、 pH 和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它所含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD 等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn-SOD 呈紫红色；Fe-SOD 呈黄褐色。SOD 催化下述反应：2H +2O2-H 2O2+O2。机体内 O2-的过量和不足均对机体不利，SO
2、D 对过量的 O2-的及时清除保证了机体内的含量的相对平衡。机体内 O2-的形成可分为生理性和病理性两方面。在一些正常生理过程中会形成一些 O2-。例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些 O2-。在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的 O2-。过量的 O2-如不及时清除，会对细胞损伤。SOD将 O2-歧化为 H2O2，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化过氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。本实验采用有机容易沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取 SOD 并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT 光还原法、化学发光法、肾上腺素自
3、氧化法、亚硝酸法等。该实验 SOD 酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达 50%的酶量定义为一个酶单位。样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝 G-250 法测定。考马斯亮蓝 G-250 在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范围内，溶液在 595nm 波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围 1-1000g。SOD 同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。用“负”显色法，核黄素经光照所产生的活性氧 O2-（氧自由基）能使氧化硝基四氮唑蓝（NBT）有黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。由于 SOD 能够抑制
4、O2-的作用，因此，电泳分离 SOD 后，凝胶上无 SOD 处应显示为蓝色，而有 SOD 处应无色透明，由此可鉴定 SOD 同工酶的酶谱（即同工酶的数量、分布活性大小） 。二、实验试剂与器材【试剂】1、 SOD 的提取ACD 抗凝剂：柠檬酸 10g，柠檬酸钠 30g，葡萄糖 25g，用适量蒸馏水溶解并 1稀释至 1000ml；0.9%NaCl：称取 NaCl0.9g，溶于 100ml 蒸馏水中； 2丙酮 395%乙醇 4氯仿 52、 SOD 活力测定50mmol/L pH8.3 磷酸缓冲液 110mmol/L EDTA 钠盐溶液 23mmol/L 邻苯三酚溶液（用 10mmol/L 盐酸配置）
5、 33、 考马斯亮蓝 G-250 法测蛋白质考马斯亮蓝 G-250 试剂：称取 100mg 考马斯亮蓝 G-250，溶于 50ml95%乙醇 1中，加入 100ml85%（W/V）的磷酸，蒸馏水定容至 1000ml。此试剂常温下可保存 30 天。标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清蛋白质 25mg，加蒸馏水溶解并定容 2至 100ml。吸取上述溶液 40ml，用蒸馏水稀释至 100ml，即为 100ug/ml 的标准蛋白质溶液。4、 SOD 同工酶鉴定40%蔗糖（W/V）：称取蔗糖加重蒸水 100ml； 110%过硫酸铵（Ap）：称取过硫酸铵 10g，溶于 100ml 重蒸水中，用时现配； 2点
6、击缓冲液：称取三是用现配羟甲基氨基甲烷 6g，甘氨酸 28.8g。用蒸馏水 3溶解并定容至 1000ml。用时稀释 10 倍。30%的 Acr-Bis 溶液：称 Acr30g，Bis0.8g，加重蒸水溶解，定容至 100ml， 4过滤后装入棕色瓶，4 保存；Tris-HCl，pH8.9 缓冲溶液：Tris（三羟甲基氨基甲烷）36.6g，加 51mol/LHCl48ml，TEMED 0.4ml，用浓盐酸调 pH8.9 后，再用蒸馏水定容至100ml；Tris-HCl，pH6.7 缓冲溶液：Tris（三羟甲基氨基甲烷）6.0g，加 61mol/LHCl48ml，TEMED 0.4ml，用浓盐酸调
7、pH6.7 后，再用蒸馏水定容至100ml；NBT 溶液：核黄素（0.01%） ，氯化硝基四氮唑蓝（NBT） （25mol/L） ，磷酸缓 7冲液（0.05mol/L、pH7.8） ，EDTA-Na2（1.0mol/L）2.8X10-3mol/L 的 EDTA-Na2（用 pH7.8,3.6X10-3mol/L 磷酸缓冲液配置） 8【器材】752 分光光度计，分析天平，具塞试管，刻度吸管（1ml，5ml） ，离心机，烧杯（50ml） ，电泳装置一套，微量进样器，注射器。三、操作步骤1.SOD 的 提 取1取 新 鲜 猪 血 20ml（ 预 先 按 0.15:1（ V/V） 的 比 例 加 入
8、ACD 抗 凝 剂 ）于 50ml 离 心 管 ， 4000r/m， 10min 离 心 ， 去 上 层 血 浆 ， 取 下 层 红 血 球 粘 稠 液 ，然 后 加 入 2 倍 体 积 的 0.9%NaCl 溶 液 清 洗 ， 4000r/m， 10min 离 心 ， 弃 上 层清 液 ， 再 加 入 2 倍 体 积 的 0.9%NaCl 溶 液 重 复 清 洗 一 次 ， 4000r/m， 10min离 心 ， 得 洗 净 的 红 血 球 粘 稠 液 。2向 洗 净 的 红 血 球 中 加 入 等 体 积 的 蒸 馏 水 ， 剧 烈 搅 拌 30min， 使 其 充分 溶 血 。 再 向
9、溶 血 液 中 缓 慢 加 入 预 冷 的 0.25 倍 体 积 的 95%乙 醇 溶 液 和0.15 倍 体 积 的 氯 仿 ， 匀 浆 呈 暗 红 色 ， 再 继 续 搅 拌 15min， 4000r/m， 10min离 心 ， 去 变 性 蛋 白 沉 淀 物 （ 对 有 机 溶 剂 敏 感 ， 沉 淀 下 来 ） ， 得 上 层 液 ， 记 为V1， 留 样 2ml。 然 后 将 清 液 在 65-70 恒 温 水 浴 中 进 行 热 处 理 ， 15min 后 取出 迅 速 冷 却 到 室 温 ， 4000r/m， 5min 离 心 除 去 沉 淀 ， 得 浅 黄 色 粗 酶 液 ，
10、记 为V2， 留 样 2ml。3向 粗 酶 液 中 加 入 等 体 积 的 丙 酮 溶 液 ， 摇 匀 ， 冰 箱 静 置1h， 4000r/min， 10min 弃 上 清 液 ， 得 沉 淀 ， 自 然 干 燥 即 得 淡 绿 色 成 品 ， 按1mg/ml 溶 于 蒸 馏 水 ， 记 为 V3， V3=2ml， 备 用 。2. SOD 活 力 测 定 1 邻苯三酚自氧化率的测定取 4.5ml 50mmol/L pH8.3 的 磷 酸 缓 冲 液 ， 4.2ml 蒸 馏 水 和 1ml 10mmol/L EDTA-Na2 溶 液 ， 混 匀 后 在 25 水 浴 保 温 20 分 钟 ，
11、取 出 后 立 即 加入 25 预 热 过 的 邻 苯 三 酚 溶 液 0.3ml， 迅 速 摇 匀 ， 倒 入 光 径 1cm 的 比 色 杯内 ， 用 10mmol/L HCl 作 空 白 ， 325nm 波 长 下 每 隔 30 秒 钟 测 光 吸 收 值 一 次 ，整 个 操 作 在 4 分 钟 内 完 成 ， 计 算 出 每 分 钟 A325 的 增 值 ， 此 即 为 邻 苯 三 酚 自氧 化 率 。 要 求 自 氧 化 速 率 控 制 在 0.070/min 左 右 。2 酶活力测定操作与基本一致，加入邻苯三酚前，先加入一定体积的 SOD 样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光
12、吸收值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。3 酶活性单位的计算根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性： 样 液 体 积样 液 稀 释 倍 数反 应 液 总 体 积 数）（单 位 活 性 %501/)/(AmlUm其中，A 0：为邻苯三酚自氧化率；A m：加酶后邻苯三酚自氧化率；总活性(U)单位活性酶原液总体积4 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝 G-250 法）： 标准曲线的制作：取 6 支具塞试管，编号，按下表加入试剂：管号试剂1 2 3 4 5 6蛋白质标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0考马斯亮蓝 G-250(ml)
13、 5 5 5 5 5 5盖上塞子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。放置 10 分钟，在 595nm 波长下比色测定光吸收值，比色应在 1 小时内完成。以牛血清白蛋白含量（ug）为横座标，光吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。 样品中蛋白含量的测定将待测的 SOD 溶解并稀释到一定浓度，取 1 支试管，准确加入 0.1ml 样品提取液，加入 0.9ml 蒸馏水和 5ml 考马斯亮蓝 G-250 试剂，其余操作与标准曲线制作相同。 蛋白质含量计算根据所测样品提取液的光吸收值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(ug)，计算其浓度。 结果处理利用考马斯亮蓝 G-250 法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数。将测得
14、的数据填入以下表格：提纯步骤 酶液总体 积 ml 蛋白质mg/ml酶活性(U/ml)总活性(U)比活性U/mg. pr回收率(%)纯化倍数除血蛋白上清热变性后上清丙酮沉淀后的四、结果与分析1 邻苯三酚自氧化速率的测定样品/时间(min) 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 450ul 0.011 0.021 0.031 0.041 0.053 0.066 0.078 0.090 40ul 0.006 0.018 0.027 0.044 0.057 0.075 0.091 0.108 )()/()/( mgUmlgUmgU总 蛋 白 质总 活 力单 位 蛋 白 质 浓 度单 位 活 力比
15、 活 力 15ul（稀释 2 倍后） 0.012 0.028 0.046 0.068 0.090 0.109 0.131 0.159邻苯三酚自氧化率（A 0）=0.072加酶样 1 后邻苯三酚自氧化率（A 1）=0.020加酶样 2 后邻苯三酚自氧化率（A 2）=0.025加酶样 3 后邻苯三酚自氧化率（A 3）=0.0362酶活性单位的测定酶样 1：单位活性=144.44酶样 2：单位活性=130.56酶样 3：单位活性=100.00X2=200.003总活性的测定酶样 1：总活性（u）=1444.40酶样 2：总活性（u）=1175.04酶样 3：总活性（u）=400.004蛋白质含量标准
16、曲线及蛋白质含量测定根据以上公式计算得出：蛋白质及浓度的测定样品 A595 蛋白质含量（ug） 体积（ul） 浓度(mg/ml)1 0.696 167.884 50 3.3572 0.322 80.907 200 0.4053 0.478 117.186 100 1.1725比活力的测定酶样 1：比活力（u/ml）=43.03酶样 2：比活力（u/ml）=321.58酶样 3：比活力（u/ml）=170.656最终结果最终实验结果提纯步骤酶液总体积ml蛋白质浓度酶单位活性酶总活性u比活性回收率%纯化倍数除血蛋白上清10 3.357 144.44 1444.40 43.03 100.00 1.0
17、0热变性后上清9 0.405 130.56 1175.04 321.58 81.35 7.47丙酮沉淀后的2 1.172 200.00 400.00 170.65 27.69 3.97从整个实验数据来看，丙酮沉淀后的酶液的回收率和纯化倍数比较高，相对来说，热变形后的酶液回收率和纯化倍数就要稍微低一点。从蛋白质标曲图的 R2 =0.9096 来看，实验结果不太准确，未达到 0.999 但可以作为本实验的参考，通过计算得到的蛋白质含量、酶活、比活力等数据可能不太准确，这可能与实验当时酶量称量不准确和操作过程有关。分离纯化要注意：防止酶变性失活，在实验的每一步都应该检测酶的活性，以确保酶的活性是否存
18、在以及酶的纯化程度。此外本实验中猪血的新鲜程度、细胞裂解溶血程度等因素也会影响实验结果。实验二 Western blotting 检测大肠杆菌重组蛋白一、实验目的利用 Western Blotting 技术，定性（或定量）检测苦荞黄酮醇合酶基因（Flavonol synthase gene, FtFLS）在大肠杆菌表达宿主菌 Escherichia coli BL(DE3)中的诱导表达。二、 实验原理黄酮醇合酶（FLS，EC 1.14.11.23）属于 2-ODD 家族，催化黄酮醇合成支路中最后一步氧化反应，也是直接合成黄酮醇的反应。FLS 可以使二氢黄酮醇在 C3 链中 C2 和 C3 之间
19、氧化形成双键，从而生成黄酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate + O2 a Flavonol + succinate + CO2 + H2O。本实验采用 PCR 的方法，在苦荞黄酮醇合酶基因（FtFLS）ORF 起始密码子前引入 Kpn 酶切位点，去掉终止密码并引入 BamH 酶切位点。克隆引入酶切位点后的 FtFLS 到表达载体 pET-30b(+)质粒中，其表达产物分别在 N-末端和 C-末端各含有 6 His 标签。重组质粒（pET-30b(+)-FtFLS）经鉴定后转化表达宿主菌 E. coli BL21(DE3)并使用 IPTG 进行诱导表达。收
20、集诱导 0 h、2 h、4 h、6 h 和 8 h 的产物，经 SDS-PAGE 后用于考马斯亮蓝 R-250 染色或 Western blotting 分析。Western blotting 的标准流程如下：蛋白质首先通过 SDS-PAGE 胺凝胶电泳分离，通过电泳转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、PVDF 膜和尼龙膜） ；将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体（Anti-His tag IgG，一抗）与重组FtFLS 蛋白的 N-末端和 C-末端
21、6 His 发生抗原 -抗体特异反应，再利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠 IgG（peroxidase-Goat Anti- Mouse IgG，二抗）与一抗发生特异结合，最后使用 DAB 进行显色。DAB 即：二氨基联苯胺（3, 3-diaminobenzidine） ，是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。DAB 在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Western blotting 等膜显色中应用广泛。三、 操作步骤3.1 样品的制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免
22、疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测大肠杆菌重组蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。材料与试剂：重组 pET-30b(+)-FtFLS 质粒、表达宿主菌 E. coli BL21(DE3)、LB 固体培养基（Kan 50g/mL） 、LB 液体培养基（10mL、50mL） 、Kan（50 mg/mL） 、IPTG（ 24 mg/mL） 、PBS 缓冲液、5 X SDS 上样缓冲液。仪器与设备：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、酒精灯、消毒酒精（75%） 、棉球、接种环、台式离心机、冰盘、Tip（10 L、200 L、1 mL） 、微量加样器（10 L、200 L、1 m
23、L） 、离心管（1.5 mL、10 mL） 。操作步骤：含重组质粒 pET-30b(+)-FtFLS 的表达宿主菌 E. coli BL21(DE3)划线于 LB 固体培养基（Kan 抗性） ，37 培养 16 h。挑选单菌落，接种至 10 mL LB 培养基（按 0.1%加入 Kan，10 L）于 37 过夜培养，即为种子液。按 2 %的接种量（1 mL）将种子液接种到 50 mL LB Kan 培养基中（按 0.1%加入 Kan，50 L） ，于 37 培养 OD600 至 0.5（约 2.5 h） 。加入 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L（100 L） ，置于 25连续诱导表达 8
24、 h，分别取诱导前 0 h，诱导后 2 h、4 h、6 h 和 8 h 的培养液 5 mL 于 10 mL 离心管中，置于冰水混合物上备用。诱导完毕后，各样品于 8000 rpm（12000 rpm 易爆管）离心 5 min 收集沉淀，用等体积 PBS（5 mL）重悬漂洗细胞 2 次，收集菌体。各管分别加入 400 L PBS 重悬细胞，加入 100 L 5 X SDS 上样缓冲液，置于沸水浴中 10 min（注意防止爆管） 。注意事项：重组蛋白的诱导表达应进行正确的无菌操作并加入适宜浓度的抗生素，避免可能的污染。在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性。选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所
25、有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键。尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰。样品建议分装成合适的量（比如分装出 20ul 检测蛋白质定量用） ，然后保存与-20或-80中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。3.2 SDS-PAGESDS-PAGE（SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳）的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。因为 SDS-PAGE 上样缓冲液含有 SDS 和巯基乙醇（2-ME）或二巯基赤藓醇（DTT），其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键、分子内氢键、破坏蛋白质的高级结构、形成 SDS-蛋白质复合物。该复合物形成榛状结构，平均每两个氨基酸残基结合一个 SDS 分子，使其带有大量的负电荷（蛋白质分子本身的电荷完全被 SDS 掩盖），从而消除了不同分子之间原有的电荷
