1、 (1 页 ) 生物工程下游技术 一、 名词解释（每题 4 分，共 20 分） 1、 连续培养反应器：不断地往反应器中加入营养物，利用罐中的菌体增殖得到产物，并不断采出。在良好的控制下，罐内菌体的增殖速度可以与采出速度相同而达到稳态。 2、 菌体比生长速率：单位浓度菌体在一定条件下引起的反应速率 , 其值反映了培养菌体的活力 , 受菌株及各种物理化学环境的影响 . 表示为 =dx/x.dt、 qs=-ds/xdt、 qp=dp/xdt 3、 得率系数：两种物质得失之间的计量比 ,符号 Y 4、 贴壁培养 : 贴壁依赖性细胞在培养中要贴附于壁上才能迅速铺展 ,开始有丝分裂并迅速 进入对数生长期
2、,这种培养方式就叫贴壁培养 .多数动物细胞的培养都采取这种方式 . 5、 蛋白质的复性：包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。 6、 浓差极化：指在分离过程中，料液中的溶剂在压力驱动下透过膜，溶质被截留，于是在膜表面与临近膜面区域浓度越来越高。在浓度梯度作用下，溶质由膜面向本体溶液扩散，形成边界层，使流体阻力与局部渗透压增加，从而导致溶剂透 过量下降。溶剂向膜面流动引起溶质向膜面的流动，这种流动如果与浓度梯度所驱动的溶质向本
3、体溶液扩散的速度平衡时，在膜面附近就形成一个稳定的浓度梯度区，这一区域就称为浓度极化边界层，这一现象称为浓差极化。浓差极化是一个可逆的过程； 7、 膜污染：物料中的微粒、胶体粒子或溶质大分子由于与膜存在物理化学相互作用或机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸、沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化的现象。 8、 排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分 离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。 9、 分配色谱是利用溶液中被分离物质在
4、两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。 10、 有效柱长（有效迁移距离， Leff）：不同溶质在其迁移速度大于零，但小于流动相的线性流速时，溶质在色谱柱上的迁移对分离有贡献，溶质(2 页 ) 迁移所经历的柱长也对分离有贡献，而当其迁移速度等于流动相速 度时，溶质迁移所经历的柱长对分离无贡献。溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速度时，溶质在色谱柱上迁移的距离称为有效迁移距离，也称为有效柱长。 11、 吸附等温线：指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到
5、平衡时它们在两相中浓度之间的关系。 12、 切向流过滤（错流过滤、交叉流过滤、十字过滤）：就是一种维持恒压下高过滤速度的技术，其原理就是：使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用液体的剪切作用将介质表面的固体移走，当移走固体与固体沉积速率相同时，过滤速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的过滤速度。（ 实际是维持了 c).目前几乎所有的膜固液分离都采用切向流方式 13、 包含体（包涵体， inclusion bodies):存在于基因工程细胞中，主要由蛋白质构成，其中大部分是克隆表达的产物，这些产物在一级结构上是正确的，但在立体结构上却是错误的，因此没有生物学活性。难溶于水，只有在变
6、性剂溶液中才能溶解。 14、 蛋白质的复性：包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋 白质复性。 15、 切向流过滤（错流过滤、交叉流过滤、十字过滤）：就是一种维持恒压下高过滤速度的技术，其原理就是：使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用液体的剪切作用将介质表面的固体移走，当移走固体与固体沉积速率相同时，过滤速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的过滤速度。 16、 双水相萃取：利用被提取物在二相中的分配不同而实现分离的目的
7、；由于蛋白质在有机相中容易失活，因此采用的二相均为亲水相，如PEG/葡聚糖、无机盐等，称为双水相，两相密度不同，轻相富含一种高分子，重相可能富含另一高分子，细胞碎片和 蛋白质在二相间的分配系数不同，从而实现分离的目的。 17、 反渗透：在高于溶液渗透压的压力作用下，只有溶液中的水透过膜，而所有溶液中的大分子、小分子有机物及无机盐全被截留。理想的反渗透膜应被认为是无孔的，它分离的原理是溶解扩散（或毛细孔流学说）。 18、 分配系数 ：组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位： g / mL）比，称为分配系数，用
8、K 表示 19、 色谱曲线基线：无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。 (3 页 ) 20、 保留值：试样中 ,个组分在色谱柱中的 滞留时间 ,由色谱分离过程中的热力学因素控制 ,作定性参数 21、 保留时间（ tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间。 22、 死时间（ tM）：不与固定相作用的溶质，如所相色谱中气体（如空气）的保留时间。 23、 调整保留时间（ tR ）： tR = tR tM 24、 容量因子 k：平衡时，组分在各相中达到平衡时总的质量比 25、 离子交换色谱：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等
9、有关，随着流动相的 pH 值及置换剂浓度的变化而变化。 26、 排阻色谱：按组分分子大小进行分离的一种色谱。 小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 27、 亲和色谱：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。 28、 正相色谱：亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 29、 反相色谱：若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。 30、 非线性色谱 : :当组分的进样量达
10、到一定的水平时， Cm与 Cs 不存在线性关系的色谱， 一般是 制备型色谱。 31、 吸附等温线：指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。 32、 全交换容量 :每克干介质或每毫升湿介质具有的功能基含量 .是一个定值 . 33、 工作容量 :每克干介质或每毫升湿介质在一定的操作条件下的交换吸附蛋白质的实际容量 .是一个变值 . 34、 疏水性色谱 :填料表面具有弱疏水性 ,蛋白质的疏水基团与填料表面之间产生弱的疏水性相互作用 .高浓度的盐条件下 ,蛋白质与疏水固定相的吸附能力高 ,随着盐浓度的下降 ,吸附能力下降 .当淋洗液离子强度逐渐降低时 ,蛋
11、白质样品按其疏水性的不同依次被洗脱 . 35、 径向色谱：采用径向流技术的色谱 ,即样品和流动相沿径向流动 ,可以从色谱柱的周围流向圆心 ,也可以从圆心流向柱的周围 .通常采用从柱的周围流向圆心的方式 . 36、 泳动度 (迁移率 ):带电质点在单位强度电场下的泳动速度 即 :U=V/E=(d/t)/(V/L) 37、 变性胶：胶电脉在蛋白质变性的状态下进行，主要指 SDS 变性条(4 页 ) 件下进生 38、 非变性胶：电泳在蛋白质保持天然状态下进行，不加变性剂 39、 高压均浆法：高压泵将电机的旋转运动转变成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的撞击后改变方
12、向从出口管喷出，使细 胞经历较高的流速下的剪切碰撞发生较大的变形，从而达到破碎细胞的目的。 40、 线性色谱 :在色谱学中 ,如果流动相中样品的浓度与固定相中的样品浓度之间是线性关系 ,那么这种情况下的色谱分配过程就称为线性色谱 41、 生物过程动力学 :定量地描述过程的速率以及影响过程速率的诸多因素 .包括细胞生长速率、各种基质消耗的速率、代谢产物的生成速率。 42、 悬浮培养：是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程 .主要用于非贴壁依赖性细胞培养 ,如杂交瘤细胞等 . 43、 固定化培养：利用吸附或包埋等固定化的方式将细胞限制在一定的空间内 ,然后以固定化的颗粒进行悬浮培养 .该方法对贴壁性
13、和非贴壁依赖性细胞都是适合的 . 44、 膜分离技术：以半透膜为选择障碍层，允许某些组分透过而保留混合物中的其他组分，从而达到分离目的的技术。 45、 离子交换法：通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法。主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离。 46、肽谱：指蛋白质被酶解或化学降解后肽段的分离分析或制备。 二、填空题（共 20 分） 1. 超声波破碎细胞的效率与 声频 、 声能 、 处理时间 、 细胞浓度 及 细胞类型 等因素有关。 2. 目前用于固液分离的膜过滤法主要有以下三种 : 微 孔过滤 (微滤 )、 超滤 、 反渗透 。 3.
14、 在生物工程下游技术领域， 色谱 和 电泳 是目前所知最好的两种分离蛋白的方法。 4. 在生物物质分离中，可以依据一次进样量多少，将色谱分为： 分析色谱 、 半制备色谱（中等规模制备色谱） 、 制备色谱 和 工业生产规模色谱 4大类。 5. 无论是什么类型的液相或气相色谱 ,其色谱装置均应包括 : 流动相供给 、 进样 、 色谱柱 、 检测器 等四大部分。 6. 在色谱过程中，有两种将目标产品从色谱柱上洗脱下来的方法： 一种是维持流动相热力学参数不变的 等梯度洗脱法 ，另一种叫 梯度洗脱法 。 (5 页 ) 7. 径向色谱填料主要有： 离子交换树脂 和 亲和色谱填料 两种。 8. 评价 HPL
15、C 色谱填料性能的主要表征指标包括：（每空 0.5 分） 保留值 ， 选择性 , 柱效率 , 填 充 柱 的 空 喜 和 穿 透性 ,分离度 。 9. 请列举任意四种破碎细胞的方法：（每空 0.5 分） 高压匀浆法 高速珠磨法 ，超声破碎 化学渗透法 。 10. 在 HPLC 领域内经常可以遇到的吸附等温线可以有以下 5 种（形状） :（每空 0.5 分） 凹形 , 凸形 , S 形 , H形 ， 阶梯形 。 11. 羟其磷灰石在原理上一般被认为是一种 弱离子交换 色谱。（本小题 1 分） 12. 请 列 举 二 种 测 量 蛋 白 质 含 量 的 方 法 考 马 斯 亮 蓝法 ， 克氏定氮法
16、 。（ 每空 1 分）。 13. 常见的无机色谱填料主要包括： 硅胶 、 可控孔径玻璃 、 氧化铝 、 氧化钛 、 羟基磷灰石 以及 碳 和 石墨 等基质。 14. 15. 无机 HPLC 填料最常见的是以 多 孔硅胶 为基本材料的填料；含硼的 Na2O-B2O3-SiO2 系玻璃经过热处理引起相分离，生成可溶于酸的 Na2O-B2O3 相及不溶于酸的 高硅 相。将酸可溶相浸析出来后剩下的另一相就制成了可控孔径玻璃，可控孔径玻璃的主要化学成份就是 二氧化硅 。 (每空 1 分 ) 16. 不同分子量的蛋白质在电场中的迁移速度与其所带的 静电荷数 成正比，与它本身的 半径 及 溶液的 粘度 成反
17、比。 (每空 1 分 ) 17. 溶质保留置换理论的核心是： 当一个溶质被吸附剂西湖时 ,在溶质份子和吸附剂接触的表面必然会释放出一定数目的溶剂分子 。 (本小题 3分 ) 18 指出三种交联葡聚糖的微载体： Cytodex1 微载体； Cytodex 2 微载(6 页 ) 体； Cytodex 3 微载体 19 指出蛋白质复性的三种方法 ：稀释法，透析法 ，液色色谱法等 20固液分离的主要方式包括： 离心法，过滤法，双水相萃取，泡沫分离法。 21 膜的孔径一般为微米级，依据其孔径的不同（或称为截留分子量），可将膜分为 微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜 22 色谱的保留值可以用 保留时间 也可
18、以用 保留体积 来表示。 23色谱的峰宽可以用 半峰宽、峰底宽、标准偏差 表示。 24指出下列情况下色谱系统对容质的柱效和分配系统差的关系： 柱效较 高 ， K (分配系数 )较大 ,完全分离； K 不是很大 ，柱效 较高 ，峰较 窄 ，基本上完 全分离； 柱效较低， K 较大 ,但分离的不好； K 小，柱效低，分离效果更差。 25线性色谱的吸附等温线是直线，非线性色谱的吸附等温线的形状常见的有：凸形、凹形、 S 形、 H 形、阶梯形。从吸附等温线的形状可以预见色谱曲线的形状，一般凸形的吸附等温线代表色谱图是拖尾的，凹形吸附等温线代表的色谱图是吐舌头形状、 S 形的色谱图是波浪形的。 26 S
19、hepadex G25 是一种 凝胶排阻色谱 ，主要用于 脱盐 。 27 Shephadex G100 是一种 凝胶排阻色谱 ，主要用于 蛋白质的纯化 。 28 DEAE-Shaphdex A25 是一种 离子交换层析介质 。 29 CM-纤维素是一种 弱阳离子交换介质 。 30离子交换层析一般是通过梯度一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是 增加洗脱液的离子强度 ，一种是 改变洗脱液的 pH 值 。 31 QAE-葡聚糖是 强碱阴离子交换剂 ， SP 是 强酸阳离子交换剂 。 32目前径向色谱柱使用的填料主要有 离子交换树脂 和 亲和色谱 两种 ; 33蛋白质含量和纯度测定方法。含量测
20、定 :克氏定氮法， TCA 比浊度法、双缩脲法、福林 -酚法和紫外线法，考马斯兰法（ Bradford 法）。 (7 页 ) 纯度衡量 :电泳法，层析法 ，质谱法等 。一般应采用二种以上方法，而且同一原理的方法不应该采用二次。 34细胞破碎法包括：机械力和非机械力破碎方法；机械方式又包括： 液体剪切力和固体剪切力方法 ，液体剪切力包括： 高压匀浆法和超声破碎法 ；固体剪切力包括： 高速珠磨法和压榨法 。 35高压匀浆法的主要困难包括： 温控和堵塞问题 36高压匀浆法的破碎率决定于： 匀浆阀的结构，操作压力，破碎次数 。 37 蛋白质的分子量测定：超离心法： 光散射方法： 凝胶过滤法：测定完成蛋
21、白质分子的分子量。 SDS-PAGE 电泳法：是基于在 SDS 的存在下，蛋白质表面 都携带了大量负电荷而呈杆状分子，在此情况下，根据其分子形状和大小进行分离。测定蛋白质亚基的分子量，与凝胶过滤法一起用，测定用蛋白质分子量，可以方便的判断样品蛋白质是否为寡聚蛋白质。 38、 HPLC 色谱柱的关键在于 填料 39、凝胶填料主要类型： 多糖类 和 高聚物型 40、泳动度 (迁移率 )取决于 带电质点的性质 ，即 质点所带的净电荷的量、质点的大小和质点的形状。 同时决定于： 电泳介质阻力、溶液黏度 . 41、两性的生物大分子所带电荷的性质和数量由其 等电点 及 溶液环境 (pH值 )所决定 ; 4
22、2、生物物质分离的主要技术手段： 细胞破 碎、固液分离、膜分离、层析技术、电泳技术 三、是非题（请将答案填在下表中相应的题号下面，对的打“”，错的打“”，每题 1 分，共 10 分） 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 1. 错 微波加热法破碎细胞特别适合于对热 (不 )稳定的的产物的提取。 2. 对 凝胶过滤操作中，通常上样量越小，分辨率越高。 3. 对 利用液相色谱方法对包含体蛋白质进行复性比稀释复性法优越 . (8 页 ) 4. 对 一旦液料开始与膜接触，膜污染就开始发生。 5. 对 浓差极化是一个可逆的过程。 6. 错 膜污染是一个可逆的过程。 7. 对 层析系统中
23、,有效柱长 最短柱长是使最难分离的一对溶质将达到完全的基线分离的必要条件 . 8. 对 层析系统中 ,当实际柱长 最短柱长 , 则该分离过程不能达到物质的有效分离 . 9. 对 层析过程中 ,有效柱长是随层析条件的变化而变化的 . 10. 对 层析过程中 ,可以通过改变洗脱剂的浓度变化梯度改变有效柱长和最短柱长 . 11. 错 分析色谱是线性色谱； 12. 错 制备型色谱是非线性色谱。 13. 对 只要样品进样量足够大，色谱过程就是一种非线性色谱。 14. 对 非线性色谱的保留值是可 变的，峰形是不对称的，峰高与样品量不成正比关系 15. 错 生化用离子交换树脂的电荷密度越大，其分离效果越好。
24、 16. 对 HPLC 填料的颗粒粒度的分布应该是越小越好的，最好是能实现颗粒的单分散。 17. 错 样品中蛋白质的纯度为 99%，说明该样品中目标蛋白质的含量为样品总量的 99%。 18. 对 实验室可以使用 SDS-PAGE 电泳测量蛋白质的分子量。 19. 错 所有的蛋白质电泳都是利用不同蛋白质带的电荷的差异而达到分离不同蛋白质目的的。 20. 错 硅胶在 pH114 的范围内都很稳定，因此适合于在极端 pH条件下的离子交 换色谱。 21. 错 葡聚糖凝胶排阻色谱中，上样量越大，分辨率越高。 22. 对 同一蛋白质在不同种类的缓冲液中，只要缓冲液的 pH 值相同，则蛋白质所带的电荷数量也
25、相同。 23. 错 凝胶排阻色谱的层析柱越长越好。 24. 错 细胞破碎过程应尽量彻底，使细胞碎片尽可能越小越好。 25. 对 HPLC 填料的颗粒分散范围越窄越好。 26. 对 利用聚赖氨酸 /海藻酸系统进行的细胞微囊化培养，所形成的微囊外膜的孔径的大小主要是由聚赖氨酸的分子量所决定的。 27. 对 非线性色谱的样品的保留值是可变的 . 28. 错 非线性色谱的层析峰形 一般来说是高斯正态分布的对称峰 . 29. 对 为了减小样品在洗脱过程的轴向扩散，可采取增大进样浓度减少进样量的方式。 (9 页 ) 30. 错 动物细胞培养一定要采用贴壁培养的方式。 31. 错 作为动物细胞培养的优良微载
26、体应该是刚性的。 32. 对 动物细胞培养微戴体的密度应略大于培养基； 33. 错 高速珠磨法比高压匀浆法破碎细胞的效果好。 34. 对 一般讲，亲水性膜及膜材料电荷与溶质相同的膜较耐污染。 35. 对 色谱过程中试样中的各组分具有不同的 K 值是分离的基础 36. 对 色谱过程一定温度下，组分的分配系数 K 越大，出峰越慢 37. 对 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。 38. 对 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。 39. 错 色谱柱效高说明该色谱对物质的分离度高 40. 错 分离度是由色谱柱的柱效所决定的 41. 错 分离度是由色谱柱的分配系数所决定的 42. 错 分离度是由色谱的
27、容量因子所决定的 43. 对 分离度由色谱柱的柱效率和物质间的分配系数的差异共同决定。 44. 错 分析色谱是线性色谱 ;制备色谱属于非线性色谱。 45. 错 在凝胶排阻层析中，流动相的速度越慢越有利于色谱分离和分析。 46. 对 无机高效液相色谱 填料主要是以多孔硅胶为基本材料 ,还有可控孔径玻璃 ,氧化铝 ,氧化锆 ,羟基磷灰石 ,碳和石墨等 . 47. 对 两性的生物大分子所带电荷的性质和数量由其等电点及溶液环境 (pH 值 )所决定 ; 48. 对 聚丙烯酰胺浓缩胶的原理包括其 pH 值 =6.9 为甘氨酸的等电点。 49. 对 SDS-PAGE 电泳的迁移率主要由分子量决定，分子量小
28、的移动快。 50. 对 SDS-PAGE 中 SDS 的作用是消除蛋白质间的电荷差异，也消除了分子间形状的差异。 51. 对 样品溶解不好容易造成拖尾 52. 错 Monod 常数随菌体的浓度的变化而变化？ 53. 对 Monod 常数是细胞培养过程中的一个对菌体性质的特征性常数。 54. 错 色谱柱效可从峰宽得到，色谱峰越宽，柱效越低，峰宽相同，柱效相同？ 55. 错 决定柱效的因素是分配系数。 56. 错 决定柱效的因素是容量因子。 57. 错 理论塔板数越多，柱效越高。 (10 页 ) 58. 错 可以说“ A 柱子的柱效高于 B 柱子。” 59. 错 分配系数与柱效没有关系？ 60.
29、对 容量因子与柱效有关系？ 61. 对 柱效不能表示被分离组分的实际分离效果 62. 对 用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质 63. 错 微囊化不会使传质效率受影响（微囊化的缺点：传质效率受到影响） 64. 对 生物反应器的放大要解决的主要问题是由传质效率的限制引起 65. 错 气相色谱法适用于高沸点、难挥发、热不稳定物质的分析。 66. 对 一定温度下，组分的分配系数 K 越大，出峰越慢。 67. 错 细胞破碎时破碎率越高越好。 68. 69. 70. 四单选题（请将正确答案的字母填在下表中相应的题号下面，每题 1分，共 10 分） 题号 1 2 3 4 5 6
30、 7 8 9 10 答案 C1 高效液相色谱设备最核心的部分是： （ A）高压输液 系统；（ B）高灵敏的检测系统；（ C）高效的层析柱。 A2分析型色谱一般是： （ A）线性色谱；（ B）非线性色谱；（ C）离子交换色谱 A3 DEAE-Sephadex A25 是一种： （ A）离子交换色谱填料；（ B）凝胶排阻色谱填料；（ C）亲和色谱填料 C4颗粒表面主要含 C18、 C8 基团的色谱填料适合作为： （ A）离子交换色谱填料；（ B）正相色谱填料； （ C）反相色谱填料 B5下面关于高速珠磨法和高压匀浆法破碎细胞的提法哪种是正确的？ （ A）高速珠磨法比高压匀浆法更优越； （ B）高速珠磨法和高压匀浆法各有优 点； （ C）高压匀浆法比高速珠磨法效率更高； A6多孔硅胶分子中最常见的硅羟基是： （ A）单硅羟基；（ B）二硅羟基；（ C）三硅羟基； B7羟基磷灰石是一种：
