1、1融合基因 anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3()的构建及真核表达 1隋文君, 苏世振, 胡望雄, 李红智 *, 布立敬(温州医学院浙江省重点医学遗传学实验室, 温州 325035)摘要 本研究利用 SWISS-MODEL 预测该融合蛋白的三级结构。利用 PCR的方法分别从重组 pPIC9k、重组 pBullet 和 pSecTag2B 上扩增出 3 段基因片段，即片段 anti-erbB2-scFv(简称 A)、片段 Fc-CD28-CD3()(简称 B)和信号肽序列(简称 S)。利用 SOE-PCR 将 3 段序列连接形成融合基因片段 S-A-B。经 TA 克隆扩增及鉴
2、定后，将融合基因片段与逆转录病毒表达载体 pLNCX 相连构建重组真核表达载体，电转染人淋巴瘤 T 细胞株 Jurkat，G418 筛选后用流式细胞术检测融合蛋白稳定表达情况。经预测在 anti-erbB2 scFv 与 Fc 基因片段之间不加连接肽的融合蛋白，在三级结构上可形成更佳的功能构象。经 PCR、酶切及测序鉴定均证实成功构建重组真核表达载体 pLNCX/S-A-B(在 A 与 B 基因片段之间不加 linker)。经流式细胞术检测，在转染的 Jurkat 细胞中融合蛋白表达率约为56.17%。本研究应用分子克隆的方法成功地构建了重组真核表达载体pLNCX/anti-erbB2 scF
3、v-Fc-CD28-CD3()，融合基因能够在淋巴瘤 T 细胞株中表达，为制备含该融合基因的原代 T 淋巴细胞，进行 erbB2 过表达肿瘤的靶向基因治疗研究奠定了实验基础。关键词 erbB2; 融合基因; 表达载体; 肿瘤治疗HER2/c-erbB-2是编码一种生长因子受体(HER2/c-erbB-2受体)的癌基因。HER2作为一种重要的肿瘤相关抗原，在肿瘤靶向治疗中倍受关注 1。目前，在以HER2为靶向/靶点的抗肿瘤治疗研究中，以单克隆抗体 Herceptin应用最为广泛。但对Herceptin进行的临床实验证明，其有效率较低。本实验应用基因工程的方法对抗erbB2单链抗体可变区基因(sc
4、Fv) 进行改造，构建融合基因anti-erbB2-scFv-Fc-CD28-CD3()，不仅保留抗原结合特异性，增收稿日期: 2010-07-05 接受日期: 2010-09-13浙江省自然科学基金(No.Y205171)和温州市科技局对外合作项目(No.H20080059)*通讯作者。Tel: 0577-86699656, E-mail: 2加抗体Fc段使其接近全抗体的效果，并引入CD28的跨膜区使其成为T细胞膜表面锚定型抗体，引入CD3的 链充分激活T 细胞的抗肿瘤活性。本实验所构建的含anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-融合基因的T 细胞能够同时发挥体液免疫和细胞免疫的双重
5、作用来产生免疫应答从而彻底清除肿瘤细胞。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 载体和质粒 pMD19 Simple T 购自大连宝生物公司，pLNCX 购自杭州远方生物公司，含 Fc-CD28- 的重组 pBullet 由温州医学院俞康教授赠予，含anti-erbB2 scFv 的重组 pPIC9k 由中国科技大学刘兢教授赠予，pSecTag2B 购自Invitrogen。1.1.2 细胞株 人急性淋巴瘤 T 细胞株 Jurkat 购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。1.1.3 培养基 (液) LB 培养基和 RPMI1640 培养液购自上海生工，FBS 购自杭州四季青生物工程公司。1.
6、1.4 主要试剂 Ex Taq 酶、Pyrobest Taq 酶、Hind 、Cla 和 T4 连接酶均购自大连宝生物公司，PCR 产物琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒和 G418 均购自上海生工，Lipofectin 2000 购自 Invitrogen，anti-human IgG FITC和 Mouse IgG1 FITC 购自 BD 公司。1.2 方法1.2.1 融合基因的蛋白表达结构预测 已知融合基因各片段 DNA 标准序列便可利用 SWISS-MODEL 预测该融合蛋白膜外区的三级结构。通过比较三级结构，评估两种连接方式(scFv 与 Fc 之间加连接肽或不加连接肽 )的优
7、缺点。1.2.2 pSecTag2B、重组 pPIC9K 和重组 pBullet 的转化、筛选、提取及电泳鉴定1.2.3 3 段目的基因片段的获取及融合基因的构建 根据已知的 signal(简称 S)、anti-erbB2-scFv(简称 A)、 Fc-CD28-CD3()(简称 B)3 段目的基因片段的 DNA 序列，利用 Primer Premier 5.0 和 Oligo6.0 设计普通 PCR 及 SOE-PCR 引物( 表 1)，引物由上海生工合成。3Table 1 Primers for amplifying three gene fragments (regular PCR an
8、d SOE-PCR, 5-3)Fragments Primers Tm ()SABSF：GCT GGA AGC TT A GCA TGG AGA CAG ACA CACSR： GTC AGC ACA ATG TCG TCA CCA GTG GAA CCTAF：CTG GTG ACG ACA TTG TGC TGA CCC AAA CTAR：TCG GCT GAC GAG ACG GTG ACT GAG GTTBF： CCG TCT CGT CAG CCG AGC CCA AAT CTC CTBR：AAC CAT CGA TCA GCA TCT CTC CAG TAT TAG CG67.5067
9、.5066.2768.0870.5167.33The underscores were the sites for restriction digest, the grey-highlighted sequences were complimentary tailer sequences, and the dotted sequences were start or termination codons. SF and AR were used as primers for amplifying S-A fragment in SOE-PCR, SF and BR were used as p
10、rimers for amplifying S-A-B fragment in SOE-PCR.应用高保真 Pyrobest Taq 分别从 pSecTag2、重组 pPIC9K 和重组 pBullet 上普通 PCR 扩增 3 段目的基因片段 S、A 和 B(PCR 反应程序见表 2)。经电泳鉴定后，回收目的片段。Table 2 PCR procedure for amplifying three gene fragments (S, A, and B)Fragments PCR proceduresS 94 5 min; 94 30s, 59 30s, 72 45sec, 30 cycle
11、s; 72 5minA 94 5 min; 94 30s, 58 45s, 72 1min, 30 cycles; 72 8minB 94 5 min; 94 30s, 59 45s, 72 2min, 30 cycles; 72 8min用高保真 Pyrobest Taq 进行 SOE-PCR 先将片段 S 与片段 A 相连得片段 S-A，经电泳鉴定后回收，之后再用 Ex Taq 进行 SOE-PCR 将片段 S-A 与片段 B相连得融合基因片段 S-A-B，并且在 S-A-B 尾端带上碱基 A 方便下一步进行TA 克隆，经电泳鉴定后回收。实验中 SOE-PCR 的反应条件为 94 5 mi
12、n；94 30s ，55 1 min，72 2.5min，30 个循环； 72 8min。1.2.4 融合基因的 TA 克隆、转化及鉴定 按照 pMD19 Simple T 载体使用说明进行 TA 克隆，将融合基因转化、筛选、培养后提取质粒 DNA，并进行电泳、酶切、测序鉴定。1.2.5 重组表达质粒的构建、转化及鉴定 分别对逆转录病毒表达载体pLNCX 和重组 pMD19 Simple T 载体，用 Hind和 Cla进行双酶切，回收纯化融合基因片段和 pLNCX 载体片段，利用 T4 连接酶连接。将连接产物转化到E.coli DH5a 感受态细胞中，筛选、培养后提取质粒 DNA，并进行电泳
13、、PCR 、4测序鉴定。1.2.6 重组表达质粒 pLNCX/S-A-B 的转染及融合蛋白表达检测 电转染、筛选及检测 将 3040 g/50 l 重组表达质粒在 1 000 F、140V 下电转染(510) 106 /50 l Jurkat 细胞。离心收集转染 48 h 后的细胞，完全培养液培养过夜后加入含 800 g/ml(最小致死浓度)G418 的完全培养液进行克隆筛选，同时用未转染的细胞加入相同浓度 G418 作对照，每 2 天换液， 10 天后 G418 浓度降至 400 g/ml，以维持筛选作用，14 天后，收集细胞。流式细胞术检测融合蛋白表达，实验组采用 anti-human I
14、gG FITC，同型对照组采用 Mouse IgG1 FITC。2 结果2.1 融合蛋白的三级结构预测在两种连接方式下(scFv 与 Fc 之间加 linker 或不加 linker)，scFv 段保持相同的功能性构象。scFv 与 Fc 之间加 linker(图 1A)，不仅 linker 段没有形成正常的无规则卷曲，新形成了两个不正常的 -折叠，而且 Fc 段构象改变，多个正常的 -折叠减少，新形成了一个不正常的 -螺旋。而 scFv 与 Fc 之间不加linker(图 1B)，Fc 段能形成正常的功能构象。(A)(B)5Fig.1 Tertiary structure of the fu
15、sion proteina: with linker (scFv-linker-Fc); b: without linker (scFv-Fc).2.2 基因片段(S、A、B)的 PCR 扩增经 PCR 扩增出 3 段基因片段，经电泳证实 S、A 和 B 片段大小正确，分别为 91 bp、775 bp 和 1 295 bp(图 2)。(A) (B)Fig.2 Electrophoretic analysis of fragment S, A and B amplified by PCRA: Lane 1 and 2, fragment S; Lane M: DL2 000 DNA marker
16、;B: Lane 1 and 2, fragment B; Lane 3 and 4, fragment A; Lane M: DL2 000 DNA marker.2.3 SOE-PCR 构建融合基因2.3.1 S 与 A 片段的连接 第一步 SOE-PCR 连接 S 与 A 片段，经电泳证实 S-A片段大小正确，为 839 bp(图 3)。6Fig.3 Electrophoretic analysis of fragment S-A amplified by SOE-PCRLane 1 and 2: fragment S-A; Lane M: DL2 000 DNA marker.2.3.
17、2 S-A 与 B 片段的连接 第二步 SOE-PCR 连接 S-A 与 B 片段，经电泳证实S-A-B 片段(A 与 B 片段之间无 linker)大小正确，为 2 122 bp(图 4)。Fig.4 Electrophoretic analysis of fragment S-A- B amplified by SOE-PCRLane 1 and 2: fragment S-A-B; Lane M: DL2 000 DNA marker.2.4 S-A-B 融合基因的 TA 克隆及鉴定重组 T 载体 pMD19 Simple T/S-A-B 进行 Hind 单酶切及 PCR 扩增，经电泳鉴
18、定( 图 5)和测序鉴定，融合基因序列正确。Fig.5 Electrophoretic analysis of recombinant T-vector pMD19 T/S-A-B digested by Hind and amplified by PCR7Lane 1: recombinant T-vector pMD19 T/S-A-B digested by Hind ; Lane 2: fusion gene S-A-B amplified by PCR; Lane M: 1kb DNA Marker.2.5 重组表达质粒的构建及鉴定重组表达质粒 pLNCX/S-A-B 构建策略图解见
19、图 6。重组表达质粒进行Hind单酶切及特异 PCR 扩增，经电泳鉴定，见图 7。经测序鉴定融合基因序列正确。Fig.6 Schematic structure of recombinant expression plasmid pLNCX/S-A-BFig.7 Electrophoretic analysis of recombinant expression plasmid pLNCX/S-A-B digested by Hind and amplified by PCRLane 1: fusion gene S-A-B amplified by PCR; Lane 2: recombin
20、ant expression plasmid pLNCX/S-A-B digested by Hind ; Lane M: 1kb DNA marker.2.6 G418 筛选 8筛选前 4 天，细胞碎片明显增多，存活细胞数目渐渐减少。筛选第 10 天，转染的实验组 Jurkat 细胞仍可见少量散在的活细胞，而未转染的对照组 Jurkat细胞均已死亡( 图 8A)。筛选第 1420 天，转染的 Jurkat 细胞状态渐渐恢复，可见单克隆细胞逐渐增多，成簇分裂生长(图 8B)。以后细胞数量逐渐增多，生长速度基本恢复正常。(A)(B)Fig.8 G418 selectionA: normal Ju
21、rkat cells (selected for 10 d, 100); B: transfected Jurkat cells (selected for 20 d, 100).2.7 流式细胞术检测融合蛋白的表达9重组质粒 pLNCX/S-A-B 稳定转染 Jurkat 细胞，经流式细胞术检测，与同型对照相比融合蛋白表达率约 56.17 %(图 9)。(A) (B)(C) (D)Fig.9 Detection of the stable expression of the fusion protein in Jurkat cells by FACSA: Normal Jurkat cell
22、s, no anti-human IgG added; B: Normal Jurkat cells, anti-human IgG added; C: Transfected Jurkat cells and selected for 32d, Mouse IgG added; D: Transfected Jurkat cells and selected for 32d, anti-human IgG added.103 讨论研究表明，约 30%50%的乳腺癌患者 c-erbB-2 过表达 1，c-erbB-2 过表达的乳腺癌患者化疗及内分泌治疗效果不佳，且倾向于早期复发，生存期缩短，这
23、种基因过表达对乳腺癌患者极为不利。除乳腺癌外，c-erbB-2 过表达的还包括卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌等肿瘤。因此 HER2 作为一种重要的肿瘤相关抗原，在肿瘤靶向治疗中倍受关注。针对 c-erbB-2 的单克隆抗体 Herceptin 在临床上的治疗效果已经被证实。但临床试验表明，其对 c-erbB-2 过表达的晚期乳腺癌的单药有效率仅为15%23%。以单链抗体为代表的靶向治疗策略是当今的一个热点。单链抗体可变区scFv 具备与全抗体一样的抗原结合能力，scFv 基因治疗较单抗治疗的优点是在实体瘤中穿透性较好，能较长时间稳定表达，且生产成本低得多
24、。Alvarez 等曾报道采用抗 erbB2 scFv 腺病毒进行卵巢癌基因治疗，且已进入期临床试验。但研究发现 scFv 与抗原的亲和力、特异性相对单抗较差，加之缺乏 Fc 段，不产生细胞介导的细胞毒作用(ADCC 效应)。而且分泌型 scFv 的原位 scFv 不能达到有效和持续水平，因此具有局限性。如何改善特异性、有效性等？Barker 和Alvarez 等 2研究提高抗 erbB2 scFv 腺病毒基因治疗卵巢癌的特异性和有效性。有报道 3采用腺病毒介导的 Herceptin 全抗体基因治疗卵巢癌。有报道将 anti-erbB2 scFv 与 IL-2 融合 4，或与免疫毒素 SEC2
25、 融合 5，或与肿瘤坏死因子TNF- 融合 6，或与 caspase-3 融合 7，或与核糖核酸酶融合 8，这些融合蛋白均具备双重抗肿瘤效应。Von Minckwitz 等 9构建的 anti-erbB2 scFv-ETA 重组抗体外毒素 A，在对过表达 erbB2 肿瘤细胞和肿瘤动物模型试验成功的基础上，已进行期临床试验，应用于过表达 erbB2 的乳腺癌、前列腺癌、头颈部癌和非小细胞肺癌等。Shahied 等 10构建 anti-erbB2 scFv-CD16 融合基因，促进效应细胞对肿瘤细胞的吞噬作用和 ADCC 效应。还有报道构建抗 erbB2 scFv-B7.2或抗 erbB2 scFv-CD8611 融合基因，激活 T 细胞。CD3- 链是 T 细胞膜上重要的信号转导分子，能影响 T 细胞的活化。近年来有报道乳腺癌、卵巢癌等肿瘤患者 T 细胞 链的表达水平低下甚至缺失，T细胞免疫功能缺陷，提示可以利用 链对肿瘤患者进行基因治疗。而且 scFv-
