1、 植物组织培养 绪论 P1 第一章 植物组织培养的基本原理 P3 第二章 植物组织培养的基本原理 P6 第三章 植物器官和组织培养 P11 第四章 胚胎培养及离体授粉 P16 第五章 花药和花粉培养 P20 第六章 植物细胞培养 P24 第八章 原生质体培养 P27 第九章 植物离体繁殖 P30 第十章 无病毒苗木培育 P33 植物组织培养基本操作 P35 1 1 绪论 植物组织培养的概念 植物组织培养是在 无菌 和 人工控制 的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其 再生成细胞或完整植株的技术。 由于培养的植物材料已脱离母体，又称为植物离体培养（
2、Plant culture in vitro)。 广义：对植物的器官、组织、细胞及原生质体进行离体培养技术 植物组织培养 狭义：对植物的组织（分生组织、表皮组织、 薄壁组织等） 及培养产生的愈伤组织进行离体培养。 1. 无菌：使培养器皿、器械、培养基和培养材料等处于无真菌、细菌、病毒等微生物的状态，以保证培养材料在培养器皿中正常生长和发育。 2. 人工控制的环境条件：对光照、温度、湿度、气体等条件进行人工控制，以满足植物培养材料在离体条件下的正常生长和发育。 3. 外植体：由活体（ in vivo)植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。（植物组织培养中，使用的各种器官、组
3、织和细胞统称为外植体。） 4. 愈伤组织：外植体因受伤或在离体培养时，其未分化的细胞和已分化的细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织。（在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。） 植物组织培养的特点 植物组织培养的主要特点是采用 微生物学的实验手段来操作植物离体的器官、组织和细胞。 具体特点表现在： 1）组织培养的整个过程都是在 无菌条件下 进行的，外植体、培养基、接种环境都须经过无菌处理。 2）组织培养在多数情况下是利用成分完全确定的 人工培养基 进行的，除少数特殊情况（进行营养缺陷型突变细胞的筛选）外，培养基中包含了植物生长所需的水分和一切大量元素、微量
4、元素、有机物和植物激素，培养基的 PH 和渗透压也是人为设定的。 因此，在组织培养中的植物材料不需依靠自身的光合作用制造养分，而是处于完全的异养状态。 2 2 3）组织培养的 起始材料 可 以是植物的器官、组织，也可以是单个的细胞（如小孢子）和三倍体细胞（如胚乳）水平上，即使是去掉了细胞壁的细胞（原生质体）在组织培养条件下也能再生完整植株。 4）组织培养物通过连续继代培养可以 不断增殖 ，形成克隆（ clone,也称无性繁殖系），或通过 改变培养基成分 ，特别是其中的植物激素的种类和配比，而达到不同的实验目的，如茎芽增殖或生根。 5）组织培养是在封闭的容器中进行的，容器内气体和环境条件可通过瓶
5、塞或其他封口材料进行交换。容器内的 相对湿度在通常情况下几乎是 100%。因此，组培苗叶片表面一般都无角质层或蜡质层 ，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。 6）组织培养的 环境 温度、光照强度和时间等都是 人为设定 的，找出这些物理因素的最适参数对组培成功也很重要。 植物组织培养的类型 广义的组织培养依外植体不同，可分为： 1、 器官培养（ organ culture）： 对植物体各部分器官及器官原基进行离体培养的方法。 常用的植物器官有：根、茎、叶、花、果实、种子 2、 组织培养（ tissue culture）： 对植物体的各部分组织进行离体培养的方法。 常用的组织有： 分生组织
6、、形成层组织、薄壁组织、韧皮部组织等。 茎 尖分生组织培养 愈伤组织培养 3、 细胞培养 (cell culture)对植物单个细胞或较小细胞团进行离体培养的方法。 常用的细胞有：性细胞、叶肉细胞、根尖细胞、韧皮部细胞等。 4、 胚胎培养： 对植物成熟和未成熟胚以及具胚器官进行离体培养的方法。 常用的材料有：幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房等。 5、 原生质体培养 (protoplast culture)： 植物组织培养的研究任务 植物组织培养的形成与发展 植物组织培养的研究历史可以 追溯到 19 世纪中期， 其开拓和发展的 理论基础 是 植物细胞的全能 性 ，即植物的每个核细胞具有母体全部基因
7、，在离体培养下，都有分化、发育成完整植株的潜在能力。 该领域的发展历史可分为 开创、奠基和建立 三个阶段。 3 3 植物组织培养的形成于发展 开创 1、 1838-1839 年，德国科学家 Schleide 和 Schwann 发表了 细胞学说 ，奠定了组织培养的理论基础 。 该学说的基本内容是： 一切生物都是由细胞构成的，细胞是生物体的基本单位，细胞只能是由细胞分裂而来。 2、 1902 年，德国植物学家 Haberlandt 根据细胞学说，提出单个细胞的植物 细胞全能性（ totipotency）理论 。 他提出： 高等植物的器官和组织，可以不断分割，直至单个细胞，这种单个细胞是具有潜在全
8、能性的功能单位，即植物细胞具有全能性。 他在论文中写道：虽然经常观察到细胞的明显生长，但从未观察到细胞分裂。 这位先驱者 失败的原因 是：实验材料高度分化；培养基过于简单。 3、 1904 年， Hanning 最先成功地培养了 萝卜和辣根菜的胚。 发现离体胚可以充分发育成熟，并提早萌发形成小苗。 1922 年，美国学者 Knudson 采用 胚培养法 获得大量兰花幼苗。 4、 1922 年，德国学者 Kotte 和美国学者 Robbins 进行 了豌豆、玉米、棉花的 茎尖和根尖离体培养 ，发现离体培养只能进行有限的生长，未发现培养细胞有形态发生能力。 5、 1925 年， Laibach 培
9、养亚麻种间杂交幼胚获得成功，证明了 胚培养在植物远缘杂交中的可能性。 植物组织培养的形成与发展 奠基 20 世纪 30-50 年代，影响立体培养材料生长和发育的一些重要物质，如 天然提取物、 B 族维生素、生长素 (auxin)、细胞分裂素 (cytokinin)的发现， 促使植物组织培养的研究迅速发展，特别是 分裂素与生长素的比例控制器官分化（ differentiation)的激素模式的建 立，使植物组织培养技术与理论体系得以形成。 Gautheret (1937,1938)在他培养的柳树形成层的培养基中加入这些物质，使生长大大加快，随后，他用胡萝卜的小外植体培养也获得成功。 1926 年
10、，植物生理学家 Went 首先发现了可以促进子叶鞘生长的物质， 1930 年证实了这种物质是 生长素 吲哚乙酸。 1937 年， White 又发现了 B 族维生素和 IAA 对植物根离体生长的作用， 并用 3种 B 族维生素 VB6、 VB1 及 VB5，取代椰汁获得成功， 建立了第一个由已知化合物组成的培养基 。 1933 年，中国学者李继侗和沈 同首次报道了利用 天然提取物 进行组织培养的研究。他们利用加有银杏胚乳提取物的培养基，成功培养了银杏的胚。 4 4 1934 年， White 用 番茄根尖 经继代培养 400 余天 (有的书上说， 28 年培养了 1600 代 )，建立起第一个
11、活跃生长的无性繁殖系，从而使 非胚器官的培养 首先获得成功。 1941 年， Van Overbeek 等将椰乳加入到培养基中，使曼佗罗的 心形期胚离体培养 成熟，并推测椰乳中 含有促进细胞分裂和生长的生理活性物质。 法国的 Nobecoort(1937,1938)培养胡萝卜根和马铃薯的 块茎薄壁组织 ，细胞增殖获得成功。不久， White(1939)报到了烟草中间杂种 (Nicotianaglauca N.longsdorffi)幼茎切段原形成层组织的培养 ，继代培养也获得成功。 在 White 和 Gautheret 工作中所确立的植物组织培养的基本方法，成为以后进行各种植物组织培养的基础
12、技术，奠定了植物组织培养的基础。 1943 年 White 发表了植物组织培养手册 ( A Hand Book of Plant Tissue Culture )的专著，使植物组织培养开始形成一门新兴的学科。 四十年代， Skoog 和崔徵 (1948)在烟草茎 切段和髓培养以及器官形成的研究中，发现 腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素对芽形成的抑制作用，而诱导形成芽， 从而确定了腺嘌呤 /生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。这一比例高时产生芽，比例低时产生根，相等时则不分化。 1956 年 Miller 等发现了激动素， 知道激动素可以代替腺嘌呤促进成芽，并且效果约可增加3 万倍。确
13、立了控制器官分化的激素模式为 激动素 /生长素的比例关系。这种器官发生的激素调空模式的建立为植物组织培养中完整植株的再生奠定了理论基础。 1953 年， Muir 利用往复式摇床的振荡，在液体培养基中 进行了万寿菊和烟草愈伤组织的培养，获得了 单细胞或密集细胞的悬浮液， 并可继代增殖。 这既是培养方法上的突破，也是Haberlandt 培养单细胞设想的实现。 1958 年，英国学者 Steward 和 Reinert 几乎同时在胡萝卜根组织的韧皮部 单细胞悬浮培养中发现，体细胞在形态上可转变为与合子胚相似的结构 ，其发育过程也与合子胚类似。由于它是从体细胞分化而来，因而称为 体细胞胚或胚状体。
14、这一实验证实了 Haberlandt 的细胞全能性理论。 植物组织培养的形成于发展 建立 1958 年， Wickson和 Thimann 发现，应用 外源细胞分裂素可以打破顶端优势 ， 促使休眠的侧芽启动生长， 从而形成微型的多枝多芽小灌木丛状结构。 1960 年， Morel 提出了利用 茎尖离体快速无性繁殖 兰花属的方法，该方法繁殖系数极高，并能脱毒，国际上相继形成了“兰花工业”，并实现了 试管苗产业化 。 5 5 1962 年， Murashinge 和 Skoog 在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的 MS 培养基。 1960 年，英国学者 Cocking 用真菌纤维素酶酶解分离番茄
15、根和烟草叶片，获得了 原生质体 ，开创了原生质体的培养。 1971 年，日本学者 Nagata 和 Takebe 首次将烟草叶肉 原生质体 培养的再生植株。 1985 年， Fujimura 获得了第一例 禾谷类作物 水稻原生质体培养的再生植株。 1986 年， Spangenberg 获得了 甘蓝型油菜单个原生质体 培养的再生植株。 1972 年， Carlson 通过 两个种的烟草原生质体融合培养 ，获得了 第一个体细胞杂交的杂种植株 。 1974 年， Kao 利用聚乙二醇进行了 大豆和烟草科间原生质体的融合。 1953 年， Tulecke 首先培养银杏 成熟花粉获得了愈伤组织 。 1
16、964-1966 年，印度科学家 Guha 和 Maheswari 在曼陀罗花药培 养中首次由 花粉诱导得到了单倍体植株 。 1969 年， Kaul 发现三角叶薯蓣悬浮培养物可以生产 薯蓣皂苷配基， 其量为干重的 1.5%。 目前，利用组织培养途径生产的次生产物有 皂苷类、生物碱、甾醇类、醌类、氨基酸和蛋白质等。 植物组织培养的形成与发展 应用及展望 1、植物离体快繁 运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。 例如一株葡萄一年繁殖到 3 万多株，一株兰花一年繁殖到 400 万株。 2、无病毒苗木培育 针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒
17、种苗。已经 取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。 3、次生代谢物的产生 有些极其昂贵的生物制品， 如抗癌首选药物 -紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。 4、培育新品种或创制新品种 1）培育远缘品种 ： 利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。比如 辽宁果树研究所利用这种方法获得苹果与梨的杂交种。 2）离体选择突变体 ： 采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。 中国林科院用逐步加大培养基中盐的浓度，直接获得耐盐的杨树株6 6 系。 3）单倍体育种 5、植物种质资源的离体保存 6、人工种子 意义： 1）结构
18、完整、体积小、便于贮藏与运输，可直接播种和机械化操作。 2）不受季节和环境限制，利于工厂化生产。 3）利于繁殖周期长、自交不亲和、珍贵稀有的植物，也可大量繁殖无病毒材料 4）可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子品质 5）体细胞胚由无性繁殖体系产生，可固定杂种优势。 7、 基因工程的应用 （ 1） 培育的优质、高产的转基因大豆新品种，蛋白质含量比标准品种提高 45% 48%，产量提高 10% 20%。 （ 2） 将鱼的抗冻基因导 入番茄，获得了耐寒、高产的转基因番茄。转基因抗盐马铃薯也获得成功 . 第一章 植物组织培养的基本原理 第一节：植物组织培养实验室 一、实验室要求 环境要
19、求：理想的植物组织培养实验室应该建立在安静、清洁、远离污染源的地方，最好在常年主风向的上风方向，尽量减少污染。 规模化生产 的实验室最好建在交通方便的地方，便于产品的运送。 需考虑两个方面：一、所从事实验的性质 二、实验室规模 实验室设置的基本原则：科学、高效、经济和实用。 二、实验室组成 （一）基本实验室 基本实验室包括准备室、无菌操 作室、培养室、缓冲间，是植物组织培养实验所必须具备的基本条件。如进行工厂化生产，年产 4 万 -20 万，需 3-4 间实验用房，总面积 60 平方米。 实验室必须满足 3 个基本需要：实验准备（培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭菌）、无菌操作和控制培养
20、。 1、准备室 7 7 功能： 进行一切与实验有关的准备工作 ：器皿洗涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等。 要求： 20 平方米左右。 要求宽敞明亮、以便于放置多个实验台和相关设备，方便多人同时工作；同时要求通风条件好，便于气体交换；实验室地面应 便于清洁，并应进行防滑处理。 设备：准备室应具备工作台、柜橱、水池、仪器、药品等。 分类： 分体式 -研究性质实验室 ，可将准备室分解为药品贮藏室、培养基配制与洗涤室和灭菌室等，功能明确，便于管理，不适于大规模生产。 通间式 -规模化实验室，设计成大的通间，试验操作的各个环节在同一房间内按程序完成 。便于程序化操作与管理
21、，减少各环节间的衔接时间，提高工作效率。还便于培养基配制、分装和灭菌的自动化操作程序设计，减少规模化生产的人工劳动，更便于无菌条件的控制和标准化操作体系的建立。 2、无菌操作室 功能：也叫 接种室，进行材料的离体无菌操作，是植物离体培养研究或生产中 最关键的一步 。 要求：房间一般不宜过大， 10-20 平方米即可 。要求 封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌 ，因此不宜设在容易受潮的地方；为便于消毒处理，地面及内墙壁都应采用防水和耐腐蚀材料；地面要求平坦无缝，便于清洁；为了保持清洁，无菌室应 防止空气对流 。 一般新建实验室的无菌室在使用之前应进行灭菌处理，处理方法是 甲醛和高锰酸钾熏蒸
22、，并需定期灭菌处理，还可用 紫外线照射 1-2h/周 ，或每次使用前 照射 10-30min。 设备：无菌操作室安装有紫外灯和空 调，工作台和搁架，还有超净工作台和整套灭菌接种仪器、药品等。 3、培养室 功能：对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养， 实验材料进行培养的场所 。 要求： 10-20 平方米左右 。要求能够控制光照和温度，并保持相对的无菌环境。因此，培养室应保持 清洁和适度干燥 ；为满足植物培养材料生长对气体的需要，还应安装 排风窗和换气扇 等换气装置；为节省能源和空间，应配置适宜的 培养架 ，并应安装日光灯照明。 研究用实验室，通常可根据光照时间设置成 长日照
23、、中日照、短日照培养室 ，也可以根据温度设置成 高温和 低温培养室 ，每一个培养室的空间不宜过大，便于对条件的均匀控制。进行8 8 精细培养类型如细胞培养和原生质体培养，可采用光照培养箱或人工气候箱代替培养室。 设备：培养架、光照培养箱或人工气候箱、边台用于拍摄培养物生长状况，除湿机、显微镜、温湿度计、空调等。 4、缓冲间 功能：进入无菌室前的缓冲场地，减少人体从外界带入的尘埃等污染物。人员在此换上工作服、拖鞋、口罩，才能进入无菌室和培养室。 要求： 3-5 平方米 ，在准备室外或无菌操作室外，应保持清洁无菌；备有鞋架和衣帽挂钩。 设备： 1-2 盏紫外灯对衣物进行 灭菌、灭菌工作服、拖鞋、口
24、罩。 （二）辅助实验室 根据研究或生产的需要而配套设置的专门实验室，主要用于 细胞学观察和生理生化分析等。 1、细胞学实验室 功能：对培养材料进行细胞学鉴定和研究， 分为制片室和显微观察室。 制片是获取显微观察数据的基础，制片室配备有切片机、磨刀机、温箱及样品处理和切片染色设备，通风橱和废液处理设施。 显微观察室主要有显微镜和图像拍摄、处理设备。 要求：明亮、清洁、干燥、防止潮湿和灰尘污染。 2、生化分析实验室 培养细胞产物为主要目的实验室，应建立相应 的分析化验实验室，随时对培养物成分进行取样检查。大型次生代谢物生产，还需有效分离实验室。 第二节 仪器设备和器皿用具 一、基本设备配置 （一）
25、常规设备 1、天平 植物组织培养实验室需要 不同精度的天平 。 感量 0.001g 的天平（分析天平）和感量 0.0001g 的天平（电子天平）用于称量微量元素9 9 和一些较高精确度的实验用品。 感量 0.01g 和 0.1g 的天平，用于大量元素母液配制和一些用量较大的药品的称量。 2、冰箱 各种维生素和激素类药品以及培养基母液均需低温报存，某些试验还需 植物材料进行低温处理，普通冰箱即可。 3、酸度计 用于测定培养基及其它溶液的 pH，一般要求可测定 pH 范围 1-14 之间，精度 0.01 即可。 4、离心机 用于 细胞、原生质体等活细胞分离 ，亦用于培养细胞的细胞器、核酸以及蛋白质
26、的分离提取。根据分离物质不同配置不同类型的离心机。 细胞、原生质体等活细胞的分离用低速离心机；核酸、蛋白质分离用高速冷冻离心机；规模化生产次生产物，还需选择大型离心分离系统。 5、加热器 用于培养基的配制 。研究性实验室一般选用带磁力搅拌功能的加热器，规模化大型实验室用 大功率加热和电动搅拌系统。 6、其它 纯水器、分装设备 （二）灭菌设备 维持相对的无菌环境是植物组织培养实验室的基本要求。 1、高压灭菌锅 用于培养基、玻璃器皿以及其它可高温灭菌用品的灭菌，根据规模大小有手提式、立式、卧式等不同规格。 2、干热消毒柜 用于金属工具如镊子、剪刀、解剖刀，以及玻璃器皿的灭菌。一般选用 200左右的普通或远红外消毒柜。 3、过滤灭菌器 用于一些酶制剂、激素以及某些维生素等不能高压灭菌试剂的灭菌，主要有真空抽滤式和注射器式。 4、紫外灯
