1、作者简介：王晓闻，女，硕士 研究方向：抗体药物质量分析评价 *通讯作者：谭青乔，男，博士 研究方向：抗体药物质量分析评价 Tel：（ 021） 60753275 E-mail: tanqqcpgj- 一种抗 HER2 人源化单克隆抗体药物的药学研究 王晓闻，刘培培，吕锋华，谭青乔 *（ 抗体药物国家工程研究中心 ， 201203） 摘要： 目的 对一种用于治疗 HER2 阳性乳腺癌的抗 HER2 人源化单克隆抗体靶向生物制剂进行有效性和安全性的药学研究。 方法 采用 高效液相色谱、毛细管电泳、圆二色谱、差示扫描量热技术、液质联用和基于人乳腺癌细胞的体外活性检测以及 SPR 技术分析抗 HER2
2、抗体的 纯度、结构、翻译后修饰以及功能活性等 关键质量属性。 结果 该抗体的单体纯度 98%，聚体含量 97%；具有正确的二级与三级结构，相变温度为72.65 0.1， 和 85.08 0.1；大于 99%的分子 具有正确的糖基化修饰，且 N 糖分布大体上与参比制剂高度相似， 高甘露糖含 量 少但唾液酸含量多；对人乳腺癌细胞的增殖抑制活性和 ADCC 活性与参比制剂相当（ P=0.96），与 HER2 抗原以及 Fc 受体的结合也无显著差异。结论 该抗体在药学评价上 展现了高纯度、低杂质、结构稳定以及正确的翻译后修饰的特性，通过 如此 精心的分子和工艺设计 ，使其表现出与参比制剂相同的生物等效
3、功能作用，而且也在免疫原性和稳定性上都表现出低风险， 具备良好的安全性和有效性。 关键词 : HER2; 单克隆抗体 ; 质量 ; 有效性 ; 安全性 The Pharmaceutical Research of an Anti-HER2 Humanized Monoclonal Antibody Drug Product WANG Xiao-wen, LIU Pei-pei, LV Feng-hua， TAN Qing-qiao*（ National Engineering Research Center of Antibody Medicine， Shanghai 201203， Chin
4、a） ABSTRACT： OBJECTIVE To perform a pharmaceutical study on the efficacy and safety of a therapeutic anti-HER2 humanized monoclonal antibody targeting HER2-positive breast cancer. METHODS The critical quality attributes such as purity, structure, post-translation modifications, function and efficacy
5、 are analyzed using HPLC, CE-SDS, Circular Dichroism, Differential Scanning Calorimeter, LC-MS/MS, human breast cancer cell-based in vitro bioactivity assay and SPR binding kinetics. RESULTS The monomer content of the antibody is more than 98% while the polymer impurities are less than 2%. The sum o
6、f heavy chain and light chain peak area is over 97% on the CE-SDS electrophoretogram. The antibody drug demonstrates correct secondary and tertiary structure with two phase transition temperatures of 72.65 0.1 and 85.08 0.1 . More than 99% of the molecules are correctly glycosylated with a highly si
7、milar N-glycan profiling to the reference product. The differences exist where the experiment subject has higher content of high mannose structure but lower sialic acids. The two products keep the same level on BT474 proliferation inhibiting bioactivity and ADCC efficacy（ P=0.96） ,and show no signif
8、icant difference on the binding affinity to HER2 and Fc Receptors. CONCLUSION The antibody drug product demonstrates excellent characteristics such as high purity, few impurities, stable structure and correct post translation modifications in the pharmaceutical evaluation. By means of these well-des
9、igned molecules and production process, the drug product is proved bioequivalent to the reference product as well as low -risk of immunogenicity and stability. The antibody drug product has good safety and efficacy. KEY WORDS: HER2; monoclonal antibody ; quality;efficacy;safety 据世界卫生组织数据统计，每年有超过 50
10、万人死于乳腺癌，高居女性恶性肿瘤发病率的第一位，占所有妇女癌症的 16%。一项 全国多中心 10 年回顾临床流行病学研究显示 1，我国女性乳腺癌患者具有发病年龄早、浸润性导管癌多、肿块更大、分期更晚、 ER 和 PR表达比例更低和 HER2 比例更高（ 18%）的特点。临床上常用的乳腺癌化疗药物有紫杉类、长春碱类、铂类和蒽环类，化疗药物由于缺乏对肿瘤细胞的选择性杀伤，大多会有心脏、血液、肠胃、肝脏、肾脏或神经毒性，毒副作用明显 2。而针对肿瘤发生机制中的关键受体、基因和调控分子 3的靶向生物制剂治疗性单克隆体的出现克服了化疗药物的缺陷。经过近三十年的发展，治疗性单克隆抗体已经成功地成为肿瘤治疗
11、的主流方式，其与靶点的特异识别以及多样的免疫治疗途径决定了单抗在安全性和有效性上的特殊优势，每年全球单抗市场销售额可超过两百亿美元，产品管线以百数计 4。目前，研究较为成熟的针对乳腺癌的靶向治疗方法主要以表皮生长因子受体 2（ HER2）为靶点，因为 HER2 基因的扩增和蛋白的过度表达的乳腺癌对常规的化疗和内分泌治疗反应差，无病生存期短，预后差 5。以 HER2 为靶点的治疗性单抗以其定向性、高特异性 、安全性和低风险成为了针对 HER2 阳性乳腺癌的有效治疗方法，既能阻断 HER2 抑制乳腺癌细胞增殖，又能激活免疫系统对肿瘤细胞的攻击。然而，由于 欧美发达国家对重组单抗技术的封锁和专利垄断
12、致使 进口药品售价高昂，国内的患者选择单一却大多负担不起，这也是虽然乳腺癌被认为是发达国家的疾病，但大多数乳腺癌死亡病例（ 69%）发生在发展中国家的重要原因。可喜的是， 国内已有企业突破了哺乳动物细胞大规模培养和单抗大规模分离纯化技术壁垒，自主创新开发出产业化生产的抗 HER2人源化抗体，现已成功完成临床三期，充分证实了国产抗 HER2 人源化抗体的有效性和安全性。除了临床评价以外，药学评价更是贯穿于初始分子构建至上市后的整个生命周期，因为单抗药物由数百个氨基酸组成，分子量巨大，结构复杂，且通过哺乳动物细胞表达存在翻译后修饰造成了分子的异质性，复杂的修饰和多级结构直接影响到单抗的药效功能，蛋
13、白质较不稳定的特性和复杂且随着技术更新而变化的生产工艺也与其质量和安全性息息相关。为了揭示一种 HER2 人源化单克隆抗体产品的有效性和安全性，本研究采用高效液相色谱法、毛细管电泳法、基于人乳腺癌细胞的体外活性检测法、 SPR 技术、质谱技术、圆二色谱技术、差示 扫描量热技术等多种技术手段分析了该单抗的关键质量属性，从药学研究角度解析了该单抗药物的分子结构设计、杂质纯度与其安全有效的良好质量表现之间的内在关系。 1. 材料与方法 重组抗 HER2 人源化单克隆抗体（ MAb302），规格 50mg/支，商品名赛普汀，上海中信国健药业股份有限公司生产。参比生物制剂为赫赛汀 。活性试验中使用自制的
14、参考品作为参比品。 1.1 还原型毛细管凝胶电泳 CE-SDS 纯度和杂质分析： 样品经 -巯基乙醇还原和 SDS 变性后在 PA800 plus 毛细管电泳仪（ Beckman Coulter）上进行 CE-SDS 分析， 10kV 电压进样， 15kV 电压下进行分离， 214nm UV 检测器进行信号采集。 1.2 分子 排阻 液相色谱 SECHPLC 纯度和杂质分析： 使用 Dionex U3000 高效液相色谱系统（ Thermo Fisher）和 TSK-Gel G3000SWXL5m 7.8*300mm 色谱柱 (Tosoh Bioscience)对样品进行 分离， 20g 样品
15、经 200mM 磷酸盐缓冲液等度洗脱后， 280nm UV 检测器进行信号采集。 1.3 分子 排阻色谱分离静态光散射 SEC-DLS 法测定聚体分子量： 使用 Agilent 1260 高效液相色谱系统（ Agilent Technologies ）和 TSK-Gel G3000SWXL5m 7.8*300mm 色谱柱 (Tosoh Bioscience)对样品进行 分离， 200g 样品经200mM磷酸盐缓冲液等度洗脱后，先经过 280nm UV检测器进行信号采集，后串联 ZMV2000动态光散射粒度仪 （ Malvern）检测散射光强计算分子量。 1.4 圆二色谱分析： 圆二色谱扫描在
16、Chirascan 圆二色谱仪 （ Applied Photophysics）上完成。 分别在远紫外区 260-180nm 和 近紫外区 360-250nm 波段下对样品进行扫描，远紫外区采用 0.5mm 光径长的石英比色皿，样品浓度为 0.2mgmL-1，并以同比例稀释的制剂缓冲液作为背景对照；近紫外区则采用 10mm 的比色皿，样品浓度为 1.0 mgmL-1。 1.5 Tm 值分析 Tm 值分析在 MicroCal VP-Capillary DSC 差示扫描量热仪 (GE Heathcare)上完成。用样品的缓冲液稀释样品到 0.5 mgmL-1，从 10 110 逐渐升温蛋白发生去折叠
17、，检测其热熔变化计算 Tm 值，即 50%蛋白发生变性的相变温度。 1.6 N-糖基化分析： 样品经糖苷酶 PNgase F(New England biolabs)酶切 18h 后，用 3 倍体积的冰乙醇沉淀脱糖蛋白后离心 取上清液于 60 烘干。用过量的 2-AB（ 国药试剂） 于 65 标记 N-寡糖 3 小时，标记后经 固相萃取 小柱 Cleanert HILIC（ 天津博纳艾杰尔科技 ） 去多余的标记液及杂质，纯化后的 N-寡糖溶液经离心后取上清经 ACQUITY UPLC BEH 1.7um 2.1*150mm Glycan 色谱柱（ Waters）分离后先经过荧光检测器 330n
18、m 激发光和 420nm 发射光检测 N-寡糖 荧光 信号，后串联 XEVO G2 Q-Tof 质谱（ Waters） 进行 N-寡糖 的分子量鉴定。 1.7 细胞增殖抑制活性试验 采用人乳腺癌细胞系 BT-474（ ATCC HTB-20）检测样品对细胞增殖的抑制功能活性。样品 2 倍比稀释 13 个浓度加样到铺有 BT-474 细胞的培养板中， 37 5%CO2 培养 7 天后，使用 CellTiter 96 AQueous 非放射性细胞增殖检测试剂盒（ Promega）显色读数。检测结果为与自制参考品的相对活性，即四参数量效曲线 EC50值之比。 1.8 ADCC 活性试验 BT-474
19、 细胞与 NK92 CD16a 细胞以 1： 5 比例铺板，样品 3 倍比稀释 10 个浓度加样，37 5%CO2 孵育 46h 后离心取上清，使用 CytoTox-Glo 细胞毒性检测试剂盒（ Promega）显色读数。检测结果为与自制参考品的相对活性，即四参数量效曲线 EC50 值之比。 1.9 与 HER2 抗原的结合活性试验 Recombinant HumanErbB2/HER2（北京义翘神州） 12gmL-1 包被于 ELISA 板上，样品 2 倍比稀释 11 个浓度加样，孵育后使用 HRP 标记 anti-Human Ig G(Fc) antibody（ Sigma）作为二抗进行检
20、测，采用 TMB 显色读数。 检测结果为与自制参考品的相对 结合 活性，即四参数量效曲线 EC50 值之比。 1.10与 HER2 抗原的亲和力分析 使用 Biacore T200 分子相互作用分析仪 （ GE Healthcare） 进行亲和力分析。 Anti-Human Ig G(Fc) antibody（ GE Healthcare） 经 氨基偶联试剂盒 （ GE healthcare）偶联到 CM5 芯片上（ GE Healthcare）后， 1 g/ml 的样品和 Recombinant Human ErbB2/HER2（北京义翘神州）依次通过流路，样品被捕获而 HER2 与样品发生
21、结合解离，最后使用氯化镁再生芯片。使用5 个不同浓度的 HER2 重复此循环，采用 1:1 binding 模式拟合数据计算亲和力。 1.11与 FcRn 受体的亲和力分析 Recombinant Human FcRn、 FcRIIIa V158、 FcRIIIa F158（义翘神州） 经 氨基偶联试剂盒 （ GE healthcare）偶联到 CM5 芯片上（ GE Healthcare）后，样品通过流路与芯片上的 FcRn发生结合解离，用 Tris-NaCl 缓冲液 再生芯片。使用 6 个不同浓度的样品重复此循环，采用Two State Reaction 模式拟合数据计算亲和力。 1.12
22、与 FcRIIIa 受体的亲和力分析 Biotin CAPture Reagent（ GE Healthcare） 杂交于 CAP 芯片 （ GE Healthcare） 后，生物素标记的 Recombinant Human FcRIIIa V158、 FcRIIIa F158（义翘神州） 通过流路被链亲和素捕获固定于芯片，样品经过流路与芯片上的 FcRIIIa 发生结合解离，用盐酸胍 -氢氧化钠再生芯片。使用 6 个不同浓度的样品重复此循环，采用 1:1 binding 模式拟合数据计算亲和力。 2 结果 2.1 CE-SDS 纯度和杂质分析： 还原 CE-SDS 是根据分子量大小分离轻链、
23、重链、非糖基化重链和其他杂质的方法，能够准确的定量非糖基化重链的含量和抗体轻重链纯度。 图 1 分析结果显示，三个不同批次的MAb302 的非糖基化重链的含量均小于 1%，轻重链之和纯度均大于 97%（表 1）。对三个批次多次检测数据进行均值的统计学分析，得知 Mab302 的非糖基化重链含量的 95%置信区间为（ 0.77%0.83%），轻重链纯度的 95%置信区间为（ 97.3%97.6%）， MAb302 产品呈现高纯度的同时也展现了良好的批间一致性。 表 1 MAb302 的还原 CE-SDS 纯度和杂质分析结果 Tab.1 The results of reduced CE-SDS
24、purity and impurities analysis of MAb302 图 1 MAb302 的还原型 CE-SDS 电泳图谱 Fig.1 The reduced CE-SDS electrophoretogram of MAb302 2.2 SEC-HPLC 单体纯度和聚体杂质分析： 同毛细管凝胶电泳相似， SEC-HPLC 也是根据分子大小分离主要成分和杂质的方法。SEC-HPLC 在天然情况下通过色谱填料孔径的筛分将 MAb302 单体与其他高分子量和低分子量杂质分离，其优势在于能够准确定量聚体和单体。为了鉴定聚体的聚合度，又进行了SEC-DLS 分析，通过串联的 DLS 检测
25、器研究各峰的颗粒大小从而评估其分子量。分析结果显示（ 图 2），三个不同批次的 MAb302 的聚体含量均小于 2%，均值的 95%置信区间为（ 1.05%1.33%），单体纯度均大于 98%，均值的 95%置信区间 为（ 98.6%99.0%），远高于可接收标准 95%。 SEC-DLS 分子量分析的结果显示 MAb302 聚体的分子量基本是单体的两倍左右，为二聚体（表 2）。 表 2 MAb302 的单体纯度和聚体含量、分子量分析结果 Tab.2 The results of monomer and polymer as well as Mw analysis of MAb302 图 2
26、MAb302 的 SEC-HPLC 图谱 Fig.2 The SEC-HPLC chromatogram of MAb302 2.3 圆二色谱扫描分析： 除了通过提高纯度控制杂质对产品质量的影响以外，抗体自身的正确折叠也是保障安全性和有效性的关键要素。圆二色谱通过测量样品 分别 对远紫外波段和近紫外波段下 左右偏振光 吸收程度的差异来反应 Mab302 二级结构（ 螺旋、 折叠和 无规则 卷曲 ）和三级结构（氨基酸侧链残基）的折叠信息。对比 Mab302 与参比生物制剂的远紫外和近紫外（图 3）CD 图谱显示，两者图形一致，几乎可以重叠，显示了 Mab302 与参比生物制剂相似的二级和三级结构
27、，是 Mab302 正确折叠的证据。 图 3 MAb302 与参比生物制剂的 CD 图谱 Fig.3 The Circular Dichroism Spectrum of MAb302 and the reference product 2.4 Tm 值分析： 抗体的高级结构决定了热稳定性，因而对其安全性有重要影响。 DSC 技术测量了 Mab302和参比生物制剂在加热过程中发生去折叠而产生的热焓变化，推算 Tm 值反映了其 50%天然高级结构被破坏时的相变温度。相变温度越高，热稳定性越好。单克隆抗体因为有多个结构域，通常会有多个相变温度代表不同结构域的去折叠。 MAb302 的 Tm1 值为
28、 72.65 0.1，Tm2 值为 85.08 0.1，而参比生物制剂的 Tm1 值为 72.25 0.4， Tm2 值为 85.13 0.3（表 3） ， MAb302 的热稳定性与参比生物制剂一致。 表 3 Mab302 与参比生物制剂的 Tm 值 Tab.3 The Tm values of MAb302 and the reference product 2.5 N-糖基化分析： 对于由哺乳动物细胞表达的 MAb302 来说，拥有正确的结构和折叠尚不足以完全保障其有效性和安全性，还需要正确的糖基化修饰。糖基化修饰与单抗的功能紧密相关。首先，MAb302 与参比生物制剂的 N 糖基化位点
29、均发生在重链第 297 位天冬酰胺（数据未显示），其次经过脱糖荧光标记色谱分析的结果显示， MAb302 和参比生物制剂均以 G0F、 G1F、 G1F和 G2F 为主（图 4），具有相似的糖型多样性，符合典型的单抗糖基化特征。根据 N-寡糖的特征性结构（唾液酸、半乳糖、岩藻糖、高甘露糖）来统计 MAb302 和参比生物制剂的 N-寡糖种类和比例（表 4），可以看出两者糖型分 布总体高度相似，但略有差异，如在高甘露糖和唾液酸的含量上差异相对显著。 MAb302 含高甘露糖和含唾液酸的 N-寡糖的比例分别为 3.630.66%和 2.740.72%，而参比生物制剂的 含高甘露糖和含唾液酸的 N-
30、寡糖的比例分别为 5.740.44%和 1.580.10%， 参比生物制剂的高甘露糖含 量比 MAb302 多了 60%左右，而 MAb302 的唾液酸含量 则 比参比生物制剂多了 70%左右 ，且唾液酸均为 NANA，没有发现 NGNA。 表 4 MAb302 与参比生物制剂的糖基化分析结果 Tab.4 The N-glycan profiling of MAb302 and the reference product 图 4 MAb302 与参比生物制剂的 N-寡糖荧光色谱对比图 Fig.4 The fluoro-chromatograms of MAb302 and the refere
31、nce product 2.6BT-474 细胞增殖抑制活性： MAb302 在体内 的一种作用机制是： 靶向定位于乳腺肿瘤，与肿瘤细胞表面的 HER2 分子结合 使之解聚，从而抑制下游信号的激活 阻止其繁殖 6。 BT-474 细胞是人乳腺癌细胞，其表面大量表达了 HER2 分子，在体外将 MAb302 作用于 BT-474 细胞 能够抑制其增殖，正是模拟了体内的作用机制，而量效曲线的建立和半数有效浓度的计算能够直接反映样品对肿瘤细胞的抑制能力。三批 MAb302 的 BT-474 细胞增殖抑制相对活性为 1038%，而三批参比生物制剂的相对活性为 1035%（表 5），两者无显著差异（ P
32、=0.96） (图 5)。 表 5 MAb302 与参比生物制剂的 BT-474 细胞增殖抑制活性 Tab.5 The BT-474 proliferation inhibiting bioactivity of MAb302 and the reference product 图 5 MAb302 与参比生物制剂对 BT-474 细胞的增殖抑制量效曲线图 Fig.5 The response-dose curves of MAb302 and the reference product acting on BT-474 2.7 ADCC 活性 除了抑制乳腺癌细胞的增殖以外， MAb302 的
33、另一种作用机制 7是通过诱导 ADCC 效应激发免疫系统细胞杀伤癌细胞。体外的 ADCC 活性测试以 BT-474 为靶细胞，表达有 FcRIIIa（ CD16a） 受体 的 NK细胞为效应细胞，通过加入 MAb302 诱发 NK细胞对肿瘤细胞的杀伤，反映其 ADCC 活性。参比生物制剂的 ADCC 活性是 MAb302 的 90%（图 6）。 图 6 MAb302 与参比生物制剂的 ADCC 活性量效曲线图 Fig.6 The ADCC response-dose curves of MAb302 and the reference product 2.8 与 HER2 抗原的结合活性和亲和
34、力： 无论是通过增殖抑制还是 ADCC 效应， MAb302 发挥功能的必要条件是与 HER2 分子的结合。与 HER2 分子更强的结合能影响更强的增殖抑制和 ADCC 活性。通过终点观察的 ELISA方法和动态观察的 SPR 技术（表 6），两项试验均证实了 MAb302 和参比生物制剂具有相似的与 HER2 的结合能力和亲和力。 表 6 MAb302、参比生物制剂与 HER2 抗原的结合活性及亲和力 Tab.6 The binding activity and affinity to HER2 of MAb302 and the reference product 2.9 与 Fc 受体的
35、亲和力： 除了 Fab 段与抗原分子 HER2 的结合， MAb302 Fc 段与 Fc 受体的结合也与其功能作用紧密相关。重要的 Fc 受体主要有 FcRn 和 FcRIIIa， MAb302 与它们的结合强弱直接关系到血清半衰期和诱发 ADCC 效应的能力。通过 SPR 技术 测定了 MAb302 和参比生物制剂与 Fc受体的亲和力常数 KD(表 7)，可以看出，不管是与半衰期相关的 FcRn 受体还是与 ADCC 相关的 FcRIIIa 受体 的结合解离能力，两者在同一个数量级上， 无明显差异 。 表 7 MAb302、参比生物制剂与 Fc 受体的亲和力 Tab.7 The bindin
36、g affinity to Fc receptors of MAb302 and the reference product 3 讨论与结论 单克隆抗体虽然是巨大、复杂而且具有多重异质性的分子，但是通过各种先进的分析技术，我们能够细致准确地研究其分子结构、杂质特征含量、稳定性、功能活性，反映单抗药物的质量、有效性和安全性，保障病患用药的关键要求。 杂质含量的控制是单抗药物关键质量属性中保障药物安全性的重要标志，在满足如宿主 DNA、宿主细胞蛋白、 proteinA 残留等单抗药物常见的工艺残留杂质符合安全标准和微生物安全的前提下，与蛋白本身相关的杂质的控制更能体现生产者对 MAb302 的分子
37、结构和工艺设计的心思。小于 2%的聚体含量且聚合度为最小仅为二聚体，不但从含量上控制了杂质远在安全限度以下，而且从特性上降低了其免疫原性的风险 8,9,10，聚合程度越低，免疫原性越弱。免疫原性也与糖基化中高甘露糖含量 11和唾液酸中 NGNA12的含量相关，MAb302 较低的高甘露糖含量和 NGNA 的零存在是从分子结构设计上确保低免疫原性的实例。在高纯度、低杂质以 及单抗分子正确的翻译后修饰的基础上，正确的结构也是确保MAb302 安全和有效的重要因素。生产者设计了 MAb302 与参比生物制剂高度相似的二级和三级结构，是通过分子设计保障所需活性和功能的体现。而与安全性密切相关的稳定性表
38、现上， MAb302 需要加热到 72 以上 才开始明显地去折叠 ，完全去折叠需要 80以上的高温，足以保证其在正确的储藏温度下蛋白高级结构的稳定性。 抗 HER2 单克隆抗体的体外功能活性主要表现为对 BT-474 细胞的增殖抑制作用和介导ADCC 效应。与同样以 HER2 为靶标的参比生物制剂相比， MAb302 在此两种活性上与其没有显著差异。这可能来自于 MAb302 具有与参比生物制剂相似的与 HER2 抗原的结合能力和亲和力，与 Fc 受体一致的亲和力，也与两者相似的糖基化特征相关。糖基化的设计对单抗的功能活性、体内半衰期有着至关重要的影响作用 13。没有糖基化修饰的单抗蛋白，是不
39、存在 ADCC 活性，也不能够与 Fc 受体结合的 14,15。 MAb30299%的分子都是具有正确位点的糖基化修饰的，这是保障其具有针对肿瘤细胞的功能活性的先决条件。而与参比生物制剂高度相似的主要糖型和含量，是两者有效性可比的重要依据。对特殊类 型的 N-寡糖分析结果显示， MAb302 的高甘露糖含量较参比生物制剂低而唾液酸含量较参比生物制剂高，这可能揭示了 MAb302 具有更长的半衰期，因为高甘露糖的存在会引起甘露糖受体 16对血清中单抗这类糖蛋白的清除，而唾液酸的 含量高 17会增加血清半衰期。另外，在另一个与半衰期相关的受体 FcRn18的结合能力上，两者的亲和力具有一致水平。
40、通过对关键质量属性的分析研究，表明 MAb302 作为一个以 HER2 为靶点的人源化单克隆抗体靶向生物制剂，其精心设计的分子结构 和通过工艺设计有效控制的高纯度， 能够使其表现出与参比制剂相同的生物等效功能作用，即通过抑制乳腺癌细胞的生长和引起免疫系统对靶细胞的攻击达到治疗疗效，而且也在免疫原性和稳定性上都表现出低风险， 具备良好的安全性和有效性。 REFERENCES 1 ZHENG S, BAI J Q, LI J et al. The pathologic characteristics of breast cancer in China and its shift during 19
41、99-2008: a national-wide multicenter cross-sectional image over 10 yearsJ.Int J Cancer. 2012, 131(11):2622-2631. 2 JIANG Z F, SONG S T, YAO K T. 乳腺癌药物治疗的新策略和临床实践 J;Clinical Medication Journal （临床药物治疗杂志） ,2005, 2:1-4 3WANG Y, SUN Y. 肿瘤靶向治疗现状和发展前景 J;Chin J Oncol( 中华肿瘤杂志 ),2005,27(10):638-640. 4MA P Q.
42、 治疗性单克隆抗体 的市场现状及 展望 J;Progress in Pharmaceutical Sciences（ 药学进展） ,2005,29(1):46-47. 5 乳腺癌 HER2 检测指南编写组 ;乳腺癌 HER2 检测指南 J; Chin J Pathol(中华病理学 杂志 )， 2006， 35（ 10）： 631-633 6JUNTTILA T T,AKITA R W,PARSONS K, et al. Ligand-independent HER2/HER3/PI3K complex is disrupted by trastuzumab and is effectively
43、 inhibited by the PI3K inhibitor GDC-0941J. Cancer Cell,2009,15(5):429-440. 7 CLYNES R A,TOWERS T L, PRESTA L G, et al. Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targetsJ. NatMed,2000,6(4):443-446. 8 ROMBACH R V, KARLE A C, WOLF B, et al. Aggregation of Human Recombinant Mono
44、clonalAntibodies Influences the Capacity of Dendritic Cells to Stimulate Adaptive T-Cell Responses In VitroJ. PLoS One,2014 , 9(1):e86322. 9 FRADKIN A H, CARPENTER J F, RANDOLFH T W. Immunogenicity of aggregates of recombinant human growth hormone in mouse modelsJ. J Pharm Sci, 2009, 98(9):3247-3264
45、. 10 ROSENBERG A S. Effects of protein aggregates: an immunologic perspectiveJ. AAPS J. 2006,8(3):E5017 11 KILGORE B R, LUCKA AW, PATEL R, et al. Comparability and monitoring immunogenic N-linked oligosaccharides from recombinant monoclonal antibodies from two different cell lines using HPLC with fl
46、uorescence detection and mass spectrometry. Methods Mol Biol,2008,446:333-46. 12 GHADERI D, TAYLOR R E, PADLER K V, et al. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol., 2010,28(8):8637. 13 HOSSLER P,KHATTAK S F, LI Z J. Optimal a
47、nd consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 2009;19(9):93649. 14 JEFFERIS R. Recombinant antibody therapeutics: the impact of glycosylation on mechanisms of action. Trends in Pharmacological Sciences, 2009,30(7): 356-362 15 EFFERIS R. Isotype and glycoform selection
48、for antibody therapeutics. Arch BiochemBiophys. 2012,526(2):159-66 16 LEE SJ, EVERS S, ROEDER D, et al. Mannose receptor-mediated regulation of serum glycoprotein homeostasis.Science,2002, 295(5561):1898-901. 17 BORK K, HORSTKORTE R, WEIDEMANN W. Increasing the sialylation of therapeutic glycoprotei
49、ns: The potential of the sialic acid biosynthetic pathway. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2009,98(10): 34993508 18 ROOPENIAN D C, AKILESH S. FcRn: the neonatal Fc receptor comesof age. Nat Rev Immunol. 2007,7(9):71525 表 1 MAb302 的还原 CE-SDS 纯度和杂质分析结果 Tab.1 The results of reduced CE-SDS purity and impurities analysis
