1、 化学生物学课程设计 基因 B高表达原因分析 专 业： 化学生物学 学生姓名： 方晟，杜正宾，房蕾， 王芳琴，尹先珍 指导教师： 马亮，刘姿 时 间： 2015 年 1 月 10 日 目录 第一部分：背景介绍（方晟） . 1 第二部分：实验思路与计划（方晟） . 2 一、 实验思路 . 2 二、实验计划 . 3 第三部分：相关实验方法 . 5 一、表达载体相关方法（杜正宾） . 5 二、 RNA 干扰技术（房蕾） . 13 三、启动子与转录因子分析（王芳琴） . 17 四、免疫组化（尹先珍） . 33 五、表观遗传（尹先珍） . 41 附：排版：方晟 第 1 页 第一部分：背景介绍 （方晟）
2、世界卫生组织 2 月 3 日发表的 全球癌症报告 2014中称 2012 年中国新增癌症病例高居第一位 ，中国虽然发病率低于发达国家 ，但是新增和死 亡病例居世界第一 ，男性易发肺癌和肝癌 ，乳腺癌在全球女性中成最高发癌症 ， 2012年新增癌症病例有近一半来之亚洲，其中大部分在中国。 肺、肝、食道、胃等4 种恶性肿瘤中，中国新增病例和死亡人数均居世界首位。因此，癌症治疗形势刻不容缓。 现阶段，癌症主要治疗方式以外科切除手术、放射线治疗和化学治疗为主，但严重的副作用使得病人在治疗过程中极其痛苦。因此，寻求癌症的治疗手段，开发治疗癌症的药物，已经成为 21 世界最具有前景和潜力的研究方向，以基因
3、为主轴的治疗方式，研发特异性靶向癌细胞的基因药物已经成为开发治疗癌症药物的主流。所谓靶向治疗，是指以标准化的生物标记物来识别是否存在某种疾病特定的控制肿瘤生长的基因或基因谱，以此确定针对特异性靶点的治疗方法。是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点，来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞，所以分子靶向治疗又被称为“生物导弹”。 癌症是复杂的多基因疾病，研究癌症发病机制、寻找癌症相关蛋白异常表达、开发针对特定癌症相关靶蛋白的药物开发，已成为目前抗癌药物设计与研究的重要方向。通过比较肿瘤组织 和正常组织中基因
4、 B 表达量发现，基因 B 在肿瘤组织中特异性高表达，而在正常组织中表达水平低，可能基因 B 高表达与癌症发生相关，也可能成为治疗癌症的靶点。本课题是研究肿瘤组织中某基因 B 的过表达原因，想以此阐述基因 B 与癌症之间相关关系，为研发靶向该基因 B 相关通路蛋白的抗癌药物提供研究思路和方向。 第 2 页 第二部分：研究思路与计划 （方晟） 基因表达调控是维持细胞正常活动的基础，中心法则告诉我们， DNA 可以经转录成RNA， RNA 翻译后形成蛋白质，蛋白质作为生命活动主要承担者，进行新陈代谢、 维持细胞形态等生命活动。为研究某基因在肿瘤组织中高表达原因，就必须首先要弄清基因表达的过程和调节
5、过程。下图展示基因表达调控的不同层次。然后可以根据不同层次的研究，来探索基因 B 究竟在何水平调节下高表达。 图 1 不同水平上的基因表达调控 一、本课程设计思路 本课程设计主要是在转录水平探索基因 B 过表达原因 1. 基因 B 在其相关信号网络中分析 基因 B 上下游基因与基因 B 相关关系研究（设定上游基因为基因 C，下游基因为基因 D） 1.1 查找文献，是否有基因 B 与上下游基因 C 或 D 相关关系研究 1.2 基因 C 或 D 高表达 所使用方法：表达载体构建 检测指标：基因 B、基因 C 或 D 表达蛋白量 1.3 基因 C 或 D 敲出或沉默 所使用方法： RNAi 技术
6、检测指标：基因 B、基因 C 或 D 表达蛋白量 若出现阳性结果，则进一步研究肿瘤组织中基因 C 或 D 的相关表达量和调控。方法和本课题相关方法一致，是重复研究，直到最终确证原因。 2. 基因 B 相关转录因子分析 寻找基因 B 相关转录因子，基因 B 与相关转录因子关系研究 2.1 查找文献，是否有基因 B 与其相关转录因子关系研究 2.2 基因 B 启动子分析 所使用方法：启动子分析软件 目的：寻找基因 B 相关可能转录因子 2.3 基因 B 相关可能转录因子验证 第 3 页 所使用方法：同 1.2 和 1.3.即高表达或者沉默基因 B 相关可能转录因子，所使用手段与 1.2、 1.3
7、相同 需要研究相关可能转录因子是否在该肿 瘤组织中高表达。 3. 其他分析 RNA 剪接， RNA 稳定性研究，翻译因子调控，蛋白活性调节，蛋白质稳定性和降解机制，表观遗传等 图 2 研究思路分析 二、 实验计划 L 1 进行基因 B 相关生物信息学分析，分析其在肿瘤基因组中的位置，序列上下游信息等 目的：为后期实验做准备。 L 2 检测基因 B 在正常组织和肿瘤组织的 mRNA 表达含量 方法： RT-PCR， Northern Blot 等 目的：该实验验证区分基因 B 表达究竟是转录前，转录水平还是转录后，翻译，翻译后水平上的调节 结果预测：若正常组织和肿瘤组织基因 B 的 mRNA 水
8、平抑制，那么就说明可能不是转录调控相关的调控，反之，肿瘤组织基因 BmRNA 水平高，那么说明在转录前或者转录调控过程中，该基因 B 在肿瘤组织与正常组织中不同，可能其高表达与转录调控有关。 L 3 构建基因 C 或 D 的表达载体，细胞转染到肿瘤细胞中，培养后检测基因 C 或 D，基因B 的表达产物含量 方法：表达载体构建和细胞转染转化相关实验， Northern Blot， Western Blot 等 目的：高表达基因 B 上下游基因，看基因 B 表达量，看上下游信号与基因 B 是否有相关。 结果预测：与对照组比较，若基因 B 高表达，则可能与上下游基因相关，反之，则可能无关。 L 4
9、设计并构建基因 C 或 D 的 shRNA 的慢病毒载体，细胞转染，利用 Western Blot 检测shRNA 功能，而后，选取最佳设计的 shRNA 的慢病毒载体，转染到肿瘤细胞中，培养后，检测基因 C 或 D，基因 B 的表达产物含量 方法： RNAi 技术相关实验，慢病毒载体构建，细胞转染， Northern Blot， Western Blot 等 基因B过表达原因 转录水平 （重点） 转录后水平： RNA 剪接， RNA 稳定性相关 翻译水平：翻译因子相关研究 翻译后水平：蛋 白活性调节，蛋白稳定性与降解 转录前水平：表观遗传相关： DNA 甲基化，乙酰化等 信号网络调节：上下游
10、基因与基因 B 关系 转录因子与启动子分析 第 4 页 目的：基因沉默基因 B 上下游基因，看基因 B 表达量，看上下游信号与基因 B 是否有相关。 结果预测： 与对照组比较，若基因 B 表达水平相对低，则可能与上下游基因相关，反之，则可能无关。 L 5 基因 B 启动子分析与软件预测转录因子，而后，查找预测的转录因子是否在该肿瘤组织中高表达，而后，选出备选方案，将备选的转录因子利用与 L 4 类似的步骤进行 RNAi 干扰沉默，随后检测备选转录因子含量，基因 B 表达产物含量 方法：启动子分析预测软件， RNAi 技术相关实验，细胞转染， Northern Blot， Western Blo
11、t等 目的：寻找基因 B 的转录因子并验证。 结果预测：若沉默该转录因子后，基因 B 表达水平相对变低，那么 ，测说明可能该转录因子与基因 B 表达相关。反之，则可能无关。若全部筛选完转录因子后都是基因 B 表达水平和肿瘤组织中差不多，那么，可能与转录因子无关。 L 6 启动子与转录因子相关性能分析 方法：酵母双杂交技术，电泳迁移实验， Western Blot 等 目的： 检测与目标转录因子结合的蛋白的 结果预测：可通过上述的 wenstern blot 等方法检测与目标转录因子结合的蛋白的表达量，若高表达则可能是转录激活因子，若低表达则可能是转录抑制因子。 而后可以进一步分析转录因子相关的
12、信号通路啦。不断验证。 以下可能做， L 7 表观遗传相关实验 目的：探究基因 B 在肿瘤组织中，是否通过表观遗传方式激活。 若 L 2 结果为阴性，为选出后续可能在转录后水平或翻译水平，翻译后水平，可能进行的实验 L 8 基因 B 转录组测序与基因组测序，以及进行比对。 目的：比对分析，为后续实验指导相关信息 L 9 基因 B 表达产物蛋白的免疫沉淀实验 目的：筛选出与基因 B 相互作用蛋白，以此来分析蛋白活性调节与是否与蛋白降解相关 还有很多其它方法，时间有限，这里就不例举说明了。其实整个基因 B 高表达相关的调节机制有很多，可能是基因 B 表达来路上调，也可能是 基因 B 表达产物去路阻
13、滞。 统计分析 根据每个实验，设置对照组和空白组，平行实验 3 次，计算 R 值， R 小于 0.05 才具有统计学意义。 第 5 页 第三部分：相关实验方法 一、 表达载体相关方法 （杜正宾） 1.引物设计： 引物设计 是一小段单链 DNA 或 RNA，作为 DNA 复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的 3 -OH 上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的 3 -OH，必须是游离的。 1.1 引物设计原则 1.1.1 长度： 15 30bp，其有效长度 Ln=2(G 十 C)十 (A 十 T)一般不大于 38，否则 PCR 的最适
14、延伸温度会超过 Taq 酶的最佳作用温度 (74 度 )，从而降低产物的特异性。 1.1.2G 十 c 含量：应在 40%一 60%之间， PCR 扩增中的复性温度一般是较低 Tm 值 引物的Tm 值减去 5 10 度。引物长度小于 20 时，其 Tm 恒等于 4 (G 十 C)十 2 (A 十 T)。 1.1.3 碱基分布的随机性：应避免连续出现 4 个以上的单一碱基。尤其是不应在其 3端出现超过 3 个的连续 G 或 C，否则会使引物在 G 十 C 富集序列区错误引发。 1.1.4 引物自身：不能含有自身互补序列，否则会 形成发夹样二级结构。 1.1.5 引物之间：两个引物之间不应有多于
15、4 个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免 3端的互补重叠。 1.1.6 上下游引物的互补性：一个引物的 3末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。 1.1.7 3末端：如果可能的话，每个引物的 3末端碱基应为 G 或 C。 1.1.8 引物应当超出限制性内切酶识别位点至少 3 个核苷酸。 1.2 .引物设计软件： 软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“ Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。自动搜索功能以“ Premier Primer”为
16、最强且方便使用，“ Oligo 6”其次，其他软件如“ Vector NTI Suit”、“ DNAsis”、“ Omiga”和“ Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。引物设计软件的最佳搭配是“ Oligo”和“ Premier”软件合并使用，以“ Premier”进行自动搜索，“ Oligo” 进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。 1.2.1 Primer Premier 5.0 “ Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性内切酶位点分析和 DNA 基元
17、(motif)查找。“ Premier”还具有同源性分析功能，但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、 DNA 与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。 1.2.2 Oligo 6.22 在专门的引物设计软件中，“ Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。 Oligo 5.0 的初始界面是两个图： Tm 图和 G 图； Oligo 6.22 的界面更复杂，出现三个图，加了个 Frq 图。“ Oligo”的功能比“ Premier”还要单一，就是第 6 页 引物设计。但它的引物分析功能如此强大以
18、至于能风靡全世界。 2. PCR： PCR(聚合酶链式反应）是利用 DNA 在体外摄氏 95高温时变性会变成单链，低温（经常是 60 C 左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至 DNA 聚合酶最适反应温度（ 72 C 左右）， DNA 聚合酶沿着磷酸到五碳糖 (5-3)的方向合成互补链。基于聚合酶制造的 PCR 仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 2.1 标准的 PCR 过程分为三步： DNA 变性 （ 90 -96）：双链 DNA 模板在热作用下，氢键断裂，形成单链 DNA 退火 （ 60 -65）：系统温度降低，引物与 DNA 模板
19、结合，形成局部双链。 延伸 （ 70 -75）：在 Taq 酶（在 72左右，活性最佳）的作用下，以 dNTP 为原料，从引物的3端开始以从 5 3端的方 向延伸，合成与模板互补的 DNA 链。 每一循环经过变性、退火和延伸， DNA 含量即增加一倍。如图所示：现在有些 PCR 因为扩增区很短，即使 Taq 酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在 60 -65间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。 检测 PCR 反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭， EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因
20、此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年 来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。 2.2 PCR 反应体系 10扩增缓冲液 10 l 4 种 dNTP 混合物（终浓度） 各 100 250 mol/L 引物（终浓度） 各 5 20 mol/L 模板 DNA 0.1 2 g Taq DNA 聚合酶 5 10 U Mg2+（终浓度） 1 3mmol/L 补加双蒸水 100 l 其中 dNTP、引物、模板 DNA、 Taq DNA 聚合酶以及 Mg2+的加量（或浓度）可根据实验调整。 3 RT-PCR： RT-PCR 为逆转录 PCR（
21、 reverse transcription PCR）和实时 PCR（ real time PCR）共同的缩写。逆转录 PCR，或者称反转录 PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应 (PCR)的一种广泛应用的变形。在 RT-PCR 中，一条 RNA 链被逆转录成为互补 DNA，再第 7 页 以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。 3.1 RT-PCR 技术相关试剂 oligo: 多聚体，相当于 mRNA 引物 AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶 MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶 dNTPs：脱氧核 苷酸 RNase：
22、 RNA 水解酶 PCR Buffer： RT-PCR 缓冲液 MgCl2： 2 价镁离子 2.2 操作步骤编辑 RT-PCR 反应原理 2.2.1. 总 RNA 的提取：见相关内容。 2.2.2. cDNA 第一链的合成：目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以长沙赢润生物技术有限公司提供的操作手册为例： （ 1）在 0.5ml 微量离心管中，加入总 RNA 1-5 g，补充适量的 DEPC H2O 使总体积达 11 l。在管中加 10 M Oligo（ dT） 12-18 1 l，轻 轻混匀、离心。 （ 2） 70加热 10min，立即将微量离心
23、管插入冰浴中至少 1min。 然后加入下列试剂的混合物： 10 PCR buffer 2 l 25mM MgCl2 2 l 10mM dNTPmix 1 l 0.1M DTT 2 l 轻轻混匀，离心。 42孵育 2-5min。 （ 3）加入 Superscript 1 l ，在 42水浴中孵育 50min。 （ 4）于 70加热 15min 以终止反应。 （ 5）将管插入冰中，加入 RNase H 1 l ， 37孵育 20min，降解残留的 RNA。 -20保存备用。 2.2.3 PCR： （ 1）取 0.5ml PCR 管，依次加入下列试剂： 第一链 cDNA 2 l 上游引物（ 10pM
24、） 2 l 下游引物（ 10pM） 2 l dNTP(2mM) 4 l 10 PCR buffer 5 l Taq 酶（ 2u/ l） 1 l （ 2） 加入适量的 ddH2O，使总体积达 50 l。轻轻混匀，离心。 （ 3） 设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28-32 个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在 PCR 扩增目的基因时，加入一对内参（如 G3PD）的特异性引物，同时扩增内参 DNA，作为对照。 （ 4） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。 （ 5） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。 第 8 页 2.3 注意事项 2.3
25、.1 在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取过程中，注意避免 mRNA 的断裂。 2.3.2 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。 2.3.3 内参的设定：主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD（甘油醛 -3-磷酸脱氢酶）、 -Actin（ -肌动蛋白）等。其目的在于避免 RNA 定量误差、加样误差以及各 PCR反应体 系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。 2.3.4 PCR 不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应
26、通过单独实验来确定。 2.3.5 防止 DNA 的污染： （ 1） 采用 DNA 酶处理 RNA 样品。 （ 2） 在可能的情况下，将 PCR 引物置于基因的不同外显子，以消除基因和 mRNA 的共线性。 3.电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳可用做蛋白质纯度的鉴定 .聚丙烯酰胺凝胶电泳同时具有电荷效应和分子筛效应，可以将分 子大小相同而带不同数量电荷的物质分离开，并且还可以将带相同数量电荷而分子大小不同的物质分离开。其分辨率远远高于一般层析方法和电泳方法，可以检出 10-9 10-12g 的样品，且重复性好，没有电渗作用 . SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳可测定蛋白质分子量 .其原理是带大量 电荷的 SD
27、S 结合到蛋白质分子上克服了蛋白质分子原有电荷的影响而得到恒定的荷 /质比。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量已经比较成功，此法测定时间短，分辨率高，所需样品量极少（ 1 100 g），但只适用于球形或基本上呈球形的蛋白质，某些蛋白质不 易与SDS 结合如木瓜蛋白酶，核糖核酸酶等，此时测定结果就不准确 . 聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于蛋白质定量。电泳后的凝胶经凝胶扫描仪扫描，从而给出定量的结果 .凝胶扫描仪主要用于对样品单向电泳后的区带和双向电泳后的斑点进行扫描。 琼脂或琼脂糖凝胶免疫电泳可用于检查蛋白质制剂的纯度；分析蛋白质混合物的组分；研究抗血清制剂中是否具有抗某种已知抗原的抗体；检验两
28、种抗原是否相同 . 核酸电泳通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行，浓度不同的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不同的凝胶，可用于分离不 同分子量的核酸片段。 3.1 琼脂糖凝胶电泳 3.1.1.原理 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物。将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶，然后倒入胶模中，凝固后将形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。 将凝胶置电场中，在中性 pH 值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移，迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。在不同条件下电泳适当时间后，大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶的分离范围较广，用 各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为200bp 至 50kb 的 DNA。 3.1.2 琼脂糖凝胶电泳的仪器及试剂 仪器设备应包括水平凝胶电泳槽及其配套电泳梳、稳压电泳仪、微波炉或普通电炉。同时配备紫外线检测仪和照相系统。
