1、上海交通大学硕士论文硕士学位论文（20 届）蛋白与金纳米的结合动力学实验及其基于多变量分析方法的模型分析姓 名上海交通大学硕士论文学 科 、 专 业 生物学研 究 方 向指 导 教 师论文提交日期上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担学位论文作者签名：日期： 年 月 日上海交通大学硕士论文上海交通大学硕士论文上海交通大学学位论文版权
2、使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密。（请在以上方框内打“” ）学位论文作者签名： 指导教师签名：上海交通大学硕士论文日期： 年 月 日 日期： 年 月 日上海交通大学硕士论文摘要纳米技术是一个新兴的交叉研究领域，极大的影响并改变了现代医学，材料工程，生物学等学科。当纳米颗粒进入人体体液环境中时，其表面
3、会覆盖上一层蛋白质组成的“ 蛋白晕” ，蛋白晕决定着纳米颗粒在人体被靶细胞定向的识别还是被吞噬细胞所发现并迅速从人体的血流中清除出去。然而蛋白晕的动态形成过程目前仍然是不可知和不可控的，因而有必要对蛋白纳米之间的动态相互作用过程进行深入的研究。本文首先选取了人和牛血清白蛋白，将紫外动力学检测，MCR-ALS 技术 及 数学建模的手段结合到了一起，设计了比较两种高度同源蛋白 HSA 和 BSA 吸附到金纳米表面上的动力学研究，并且对它们之间发生的相互作用进行了定量和定性的分析。在此基础上，我们又进一步的用多级指数函数对该动态转换过程进行了刻画，通过对所获得的公式中的参数进行定量的分析比较了 HS
4、A 和 BSA 之间不同的吸附特性。我们发现血清蛋白和金纳米之间的结合过程可以被两个一级指数反应方程所描述，因此整个的反应可以被看做两个过程：一个快过程和一个慢过程，恰好对应于血清蛋白的三角棱柱形结构所能采取的两种可能的结合构型。而两种高度同源血清蛋白之间所显示出的不同的结合构象偏好性是受其不同的蛋白的结构特性以及表面电荷分布所决定的。基于上面的研究思路和方法，我们进一步研究了一种的更为特殊的蛋白分子REG3A。由于 REG3A 所具有的特殊结构特征，能够在细菌菌膜上自发的聚集形成六聚体为单位的跨膜通道使得细菌上海交通大学硕士论文破裂而死。而小分子脂多糖（LPS）可以起到对 REG3A 杀菌功
5、能的抑制作用。因此我们在紫外动力学检测的基础上结合了多变量分析的手段对 AuNPs-REG3A 的二元作用体系和 AuNPs-REG3A-LPS 的三元作用体系进行了研究，发现 REG3A 与金纳米之间的结合本身是一个相对复杂的过程，不像球蛋白一样是以单层的形式紧密包裹在金表面，REG3A 具有非常强的自聚集倾向从而形成纤维网络；在聚集到一定程度时，REG3A 会从金纳米表面脱落下来从而在动力学光谱上表现出反复起伏的多过程行为。在 LPS 加入后，LPS 会迅速的在 REG3A 之前吸附到纳米颗粒表面上；并且对 REG3A 蛋白的自聚集起到比较明显的抑制效应，从而出现体系的组分数减少以及结合动
6、力学曲线变平滑等现象。总的来说，本论文将紫外的快速动力学检测方法和多变量分析的手段有机的结合到了一起成功实现了对蛋白在金纳米颗粒表面所发生的动态相互作用和结合特性的探究和分析。该论文的研究思路和方法可以实现对相对复杂作用体系的有效研究。关键词：金纳米，REG3A，血清白蛋白，复杂体系，结合动力学实验，多变量分析上海交通大学硕士论文ABSTRACTNanotechnology is a new interdisciplinary research field influencing and changing the subjects including contemporary medicine
7、, material engineering and biology. When nanoparticles enter into human biofluid, its surface would be covered with a layer of coating called “protein corona”. Protein corona is deemed as the biological identity of the external intruder, and biological systems would act accordingly to either accept
8、or reject it. Based on the fact that the dynamic formation process of protein corona is still unknown and uncontrolled at present, it is essential to carry out in-depth research on the association kinetics of protein-nanoparticle interaction. For the first part of our work, a semi-quantitative inves
9、tigation was designed to compare the kinetic processes of two homologous proteins, i.e. human and bovine serum albumim (HSA and BSA, respectively), adsorbing onto the surface of gold nanoparticles by combining UV-vis spectroscopy, chemometrics technique and mathematical modelling method. Furthermore
10、, a series of equations with multiple exponential functions were used to portray the dynamic conversion of the original surface (i.e. citrate-capped nanoparticles) towards the modified surface (i.e. protein-conjugated nanoparticles). Then the adsorption modes of HSA and BSA were analyzed by double e
11、xponential function. We found that the adsorption of serum albumin on gold nanoparticle was best deciphered as the two-mode competitive kinetics. Interestingly, for human serum albumin the slower mode contributed considerably to the localized surface plasmon resonance response of protein-conjugated
12、surfaces, while in the case of bovine serum albumin the faster mode overwhelmed the slower one at the high protein concentrations. The kinetic patterns were rationalized with the diversity of bio-molecular orientations on the nanoparticle surface and protein features. Based on the research protocol
13、and method above, we further carried out the kinetic investigation of a fiber-forming protein, REG3A, adsorbing 上海交通大学硕士论文on the as-synthesized citrate-capped gold nanoparticle by combining UV-vis spectroscopic kinetic measurements and multivariate analysis method. The conjugation of REG3A on AuNPs
14、itself is a relatively complex process. Unlike globulin protein wrapping on the surface of gold in the way of single layer, REG3A has very strong self-aggregation tendency to form fiber network. After assembling to a certain degree, REG3A will fall off from the nanosurface presenting the multiproces
15、s behavior of repeated fluctuation in the kinetic spectrum, which were verified by the results of atomic force microscopy (AFM), and stability study. In the presence of LPS, this small molecule will adsorb to the surface of nanoparticle before REG3A. When the LPS concentration increases to 10 g/mL,
16、there was obvious intervention effect of REG3A adsorption on the surface of AuNPs, lessening number of components in the system and smoothing the kinetic curves. The small molecule effect on protein conjugation might provide a new solution of controlling protein modification on nanosurface.In summar
17、y, this paper successfully implemented the exploration and analysis of the kinetic interaction and conjugation characteristic of protein on AuNPs surface by combining the fast UV-vis kinetic detecting technique with multivariate analysis method. The simple but efficient protocol can be effectively u
18、sed to research on relatively complex interaction system. KEY WORDS: gold nanoparticle, REG3A, serum albumin, complex system, association kinetics, multivariate analysis上海交通大学硕士论文目录第一章 文献综述 .11.1 纳米蛋白相互作用 .21.1.1 金纳米体系 .41.1.2 血清白蛋白的介绍 .61.1.3 胰岛再生源蛋白简介 .71.2 紫外-可见光分光光度法 .81.3 结合动力学简介 .101.4 多变量分析方法在光谱研究中的应用 .111.4.1 多元曲线分辨交替最小二乘 .121.4.2 主成分分析 .141.4.3 非负矩阵分解 .151.5 本课题研究目的和意义 .191.6 本课题研究内容 .21第二章 材料和方法 .222.1 试剂和材料 .232.2 合成金纳米 .242.3 显微表征 .262.3.1 透射电子显微镜表征 .272.3.2 原子力显微镜表征 .282.4 动态光散射实验 .302.5 Zeta 电势实验 .31
