多价噬菌体分离筛选及靶向灭活.DOC

1、1 多价 噬菌体 分离筛选及 靶向灭活 土壤 病原菌 的 应用 研究 赵远超 1,2， 叶茂 2， 夏冰 3， 焦文涛 4， 冯彦房 5， 都瑞军 6，杜道林 6， 张忠云 2，黄丹 2，孙明明 1， 武俊 1， 胡锋 1， 蒋新 2，杜良成 7 （ 1 南京农业大学资源与环境科学学院，土壤生态实验室，南京 210095） （ 2 中国科学院 土壤 环境与污染修复 重点实验室 (中国科学院南京土壤研究所 )，南京 210008） （ 3 安徽省环境科学研究院，合肥 230022） （ 4 中国科学院生态环境研究中心，城市与区域生态国家重点实验室，北京 100085） （ 5 江苏省农业科学院农

2、业资源 与环境研究所，南京 210014） （ 6 江苏大学环境安全工程学院，环境生态研究所 ，镇江， 212013） （ 7Nebraska 大学 -Lincoln 校区，化学系， 美国， 68588） 摘 要 农田土壤中残留和滋生多种 病原菌 会对人体健康和 生态环境 带来显著的 安全 隐患， 开展针对性的生物修复 研究十分迫切。噬菌体疗法靶向灭活土壤中 病原菌 的技术为修复此类污染土壤提供了全新途径 。本研究以南京 城郊某 奶牛场 牛粪堆积池 周边 ， 粪肠杆菌和假单胞菌复合 污染 农田 土壤为例， 首先筛选和纯化获得 两株专一型噬菌体（ YSZ1 和 YSZ5） ， 再 人为加速其宿主

3、谱的表达过程 ， 获得 对应的 多价 噬菌体（ YSZ1R 和 YSZ5K）， 并 进行生物学特性 （ 形态、核酸、最佳感染复数、一步生长曲线等 ） 鉴定， 发现：在水相和 污染土壤中不同噬菌体对于 同步 灭活 病原菌 的能力 依次是 YSZ5K YSZ1R YSZ5 YSZ1，并且施用 多价 噬菌体疗法有助于维护 和改善修复后土壤微生物生态功能多样性与稳定性 。本研究结果 可 为噬菌体疗法 靶向灭活土壤中多种 病原菌 提供切实可行的 修复技术 。 关键词 病原菌 ； 土壤； 噬菌体 疗法 ； 靶向灭活 中图分类号 S154.1 文献标识码 A 由于 我国现阶段 畜禽粪便 安全化处理技术 或环

4、境管理仍存在一定的 不足或缺失， 许多城郊 畜牧业养殖厂周边 的 农田土壤 常成为残留和滋生 人畜共患 病原菌 的高风险热点区域 ， 严重影响人体健康和环境安全 1。因而 ，针对 病原菌 污染 农田土壤，开展必要的生物 修复技术研 2017 年度江苏省环保科研课重点项目（ 2017005）、 2017 年江苏省农业科技自主创新资金项（ CX(17)3047）、 中国科学院青年创新促进会（ 2018350）、 国家自 然科学基金面上项目（ 41771350）资助 通讯作者， E-mail： 作者简介：赵远超（ 1993-） 男 黑龙江省齐齐哈尔市 硕士研究生 主要从事噬菌体分离纯化、定向进化及

5、农业噬菌体疗法 在致病细菌污染土壤中的靶向灭活 研究 E-mail: 收稿日期： 年 -月 -日； 收到修改稿日期： 2 究十分迫切。 噬菌体疗法（ Phage Therapy） 为 修复上述 污染 土壤 提供了一种全新途径。细菌噬菌体（简称噬菌体）是一类较为专属 捕食 活体宿主细菌而存活的生物体， 在土壤、水、空气乃至人 /动物体表或肠道内均广泛分布了大量 噬菌体 ， 据估算其总量 达到 1031数量级 2。噬菌 体疗法是指通过分离、筛选、纯化和富集 宿主 病原菌 的专属 噬菌体之后 ，向 污染土壤 中添加特定噬菌体菌液，定向侵染 灭活 病原菌 的修复方式 3-4。 国外学者 已成功将 噬

6、菌体 疗法应用在灭活辣椒、番茄、葡 萄等果蔬的植物病害细菌或人畜共患 致病细 菌 的食品安全保障 领域 5-6。然而，使用噬菌体疗法来 削减 土壤中 病原菌 的生物修复 技术 研究则相对较 少。此 外，现有研究 常认为噬菌体 仅限于 侵染某一 “ 种 ” 类的 宿主细菌，而近年来 学术界 发现： 一些 噬菌体 经过 适当的 基因改造或人工加速 其宽宿主谱的表达 ，可 针对同一 “ 属 ” 内 几种高度同源性的宿主细菌， 甚至 针对不同种属之间的宿主细菌也具有一定 广谱性捕食区间 7-8。这 为 噬菌体疗法 广泛 应用奠定了坚实的理论基础。 本研究以南京 城郊 典型 奶牛场牛粪堆积池塘 周边，

7、复合 病原菌 污染 农田土壤 为例 ； 先 从污 染土壤中分离、筛选 、 加速 其宽 宿主谱表达获得多价 噬菌体 ； 接着 在水相和 实际污染土壤中验证 和 优 化 其 同步灭活多种 病原菌 的 效果和 能力， 并 评估 修复过程中的微生物生态效应。本研究结果可为靶 向 灭活农田土壤中多种 病原菌 提供切实可行的生物修复技术。 1 材料与方法 1.1 供试材料 供试菌株大肠杆菌 K12（ Escherichia coli K12， K12） 与 带红色荧光 标记（ Red Fluorescent Protein， RFP）的 铜绿假单胞菌（ Pseudomonas aeruginosa， PA

8、O1） ， 均为南京农业大学土壤生态实验室提供。供试污染土壤采自南京市横梁奶牛养殖场 （ 323045N， 118947E）牛粪堆积池附近， 采用五点取样法 ， 取 010 cm 的表层 土壤 ， 共 5 kg， 混匀，于暗处 4C 冷藏保存。测定土样基本理化性质 9：沙粒 25.5%， 壤粒 45.3%， 粘粒 29.2%， pH 7.9，全氮1.8 g kg-1，水溶性氮 1.8 g kg-1，全磷 1.1 g kg-1，全钾 17.9 g kg-1， CEC 19.9 cmol kg-1。 供试 仪器与试剂 为 台式低温高速离心机、恒温培养箱、恒温摇床；大肠杆菌直接琼脂（ Escheri

9、chia coli Direct， ECD）、假单胞菌选择性培养基（ Pseudomonas Selective Agar， PSA）、SM 缓冲液 、 Luria-Bertani（ LB） 培养基 、 环境样品病毒核酸提取试剂盒 （ PowerViral Environmental RNA/DNA Isolation Kit， Mobio 公司， 型 号 28000-50）。 1.2 噬菌体 的 分离纯化 取新鲜土壤样品 5 g， 加入 50 ml 无菌水中， 28 ， 150 rpm 振 荡培养 5 h， 10 000 rpm 离心 5 min， 上清液 经 0.22 m 滤膜除菌 ， 取

10、 9 ml 滤液与 1 ml 生长到对数期 的 宿主菌（ K12或 PAO1(RFP)）悬液加入 40 ml LB 液体培养基，加 氯化钙固体 至溶液终浓度 1 mmol L-1， 37 ，150 rpm 摇床培养 12 h。所得培养液 10 000 rpm 离心 5 min， 再 经 0.22 m 滤膜除菌，滤液即为含有噬菌体的原液 10-11。采用双层平板法 筛选 噬菌体并提纯。取上述滤液 100 l与 100 l的宿主菌悬液混匀，室温静置 15 min， 加入 3 ml 的 0.7% LB 琼脂培养基，混匀后平铺倒入 LB 固体平板上， 37 培养 10 12 h， 观察噬菌斑。待出现噬

11、菌斑，挑取单个边缘清晰 透明 的噬菌斑到含有宿主菌的 LB液体中， 37 ， 250 rpm 培养 8 h； 10 000 rpm 离心 5 min，0.22 m 滤膜除菌，滤液 保存 在 SM 缓冲液中，于 4 冰箱冷藏保存。取上述滤液适当稀释培养并倒双层平板验证，如此重复 4 6 次即可获得纯种的噬菌体。 基于上述获得的两株专一型噬菌体（以 K12 为 专一 宿主的噬菌体 命名为 YSZ1； 以 PAO1（ RFP） 为 专一 宿主 的噬菌体命名为 YSZ5）， 开展 加速 其宽宿主谱的表达 过程12-13。取 600 l3 保存的噬菌体（ YSZ1 或 YSZ5）原液 ， 分别与 200

12、 l K12 和 200 l PAO1(RFP)混合菌悬液 ，共同 加入 99 ml LB 液体培养基中， 再 加入氯化钙固体调至终浓度为 1 mmol L-1， 37 ， 150 rpm 振荡培养 96 h， 每隔 8 h 取样，将离心过滤获得的 新噬菌体与 PAO1（ RFP） 和 K12 分别倒双层平板验证，观察噬菌斑。 若出现噬菌斑则证明 表达 成功， 获得 多价 噬菌体 YSZ1R 和YSZ5K， 挑取单个清晰透明的噬菌斑富集 储存。 1.3 噬 菌体 的 生物学特性鉴定 噬菌体的形态观察 ， 将噬菌体原液滴在铜网上 ， 用 pH 7.0， 2%磷钨酸负染 90 s 后，用滤纸吸去多

13、余染液，干燥后于日立 H-7650 型透射电子显微镜下观察其形态。 噬菌体核酸提取及鉴定 ， 噬菌体核酸提取使用环境样品病毒核酸提取试剂盒 （ 核酸 提取效率 107 copies mL-1， 核酸最终体积 50 100 l） ，提取的核酸用 DNase 、 RNase 和 Hind 酶切处理并 使用 琼脂糖凝胶电泳 检验 ， 根据酶切图谱鉴定和判断其核酸 性状及 大小。 噬菌体最佳感染复数 ， 感染复数（ Multiplicity of Infection， MOI） 又称作噬菌体滴度 ，是指感染发生之前噬菌体与宿主菌数量的比值。最佳感染复数（ Optimal Multiplicity of

14、 Infection， OMOI）即获得子代噬菌体最高产量时的 MOI。取对数期宿主菌悬液 100 l，按感染复数分别为 1001、 101、 11、 1100、 11 000、 110 000 加入噬菌体。 37 摇床振荡培养 5 h。用双层平板法测定各组噬菌体 滴度 。 噬菌体一步生长曲线 ， 按最佳感染复数，取 500 l噬菌体与 500 l宿主菌悬液加入 9 ml LB液体培养基中， 37 ， 150 rpm 振荡培养，每 10 min 取样，离心过滤，并用双层平板法测定 噬菌体 滴度 14。 1.4 试验设计 噬菌体对宿主菌的灭活能力 ， 验证上述分离获得的噬菌体对宿主菌的灭活能力

15、，按照最佳感染复数添加噬菌体与 宿主菌各 100 l于 100 ml LB 液体培养基中， 37 ， 150 rpm 振荡培养。每隔 2 h 取样，每次取 200 l稀释适当 浓度， 平板计数细菌数量 。每个处理 同时 设置单独不添加噬菌体的对照 。 噬菌体疗法 在水相中 灭活 病原菌 的效果 ， 设置水相 对照组 （ CK），即： 将 K12 与 PAO1(RFP)培养到对数期后 ， 各取 100 l加入 100 ml LB 液体培养基中， 振 荡混匀， 37 ， 150 rpm 振荡培养。在 CK 基础上 ,综合 参考 最佳感染复数， 再设立四个处理，分别是 处理 1：添加 专一型 噬菌体

16、 YSZ1；处理 2：添加 多价 噬菌体 YSZ1R；处理 3；添加 专一型 噬菌体 YSZ5；处理 4： 添加 多价 噬菌体 YSZ5K。 每种噬菌体均添加 100 l（ 104 PFU mL-1） ， 每隔 4 h 取样，共监测 48 h， 每次取 200 l 菌悬液 进行 细菌计数。根据细菌平板计数判断评估噬菌体疗法在水相中对 病原菌 的灭活效果。 噬菌体疗法 在污染土壤中 的 灭活 验证研究 ， 为进一步验证噬菌体疗法在实际污染土壤中灭活多种 病原菌 的效果，本环节将进行逐一回接上述分离获得的噬菌体至污染土壤中，开展修复验证实验。重点关注土壤中粪肠杆菌（ Fecal Coliform）

17、和假单胞 菌 属（ Pseudomonas）菌群等 病原菌 的灭活效果。 共设置 5 个 实验处理， 分别是 对照组 （ CK） ：称 250 g 污染土壤，每隔 8 天以无菌水调控 土壤 含水率 至最大 田间持水量 的 80 %， 28 4 ，避 光 培养 24 天 ；处理 1：在对照组基础上添加 专一型 噬菌体 YSZ1；处理 2：在对照组基础上添加 多价 噬菌体 YSZ1R；处理 3：在对照组基础上添加 专一型 噬菌体 YSZ5；处理 4：在对照组基础上添加 多价 噬菌体 YSZ5K。 每组处理均添加噬菌体 500 l（ 104 PFU mL-1）。每隔 3 天取样，每次取 5 g 土壤

18、，平板计数法测定细菌数量。使用 ECD 培养基筛选并测定粪肠杆菌群细菌数目 ， 使用 PSA培养基筛选并测定假单胞菌群细菌数目，每个计数浓度设 3 次重复。 1.5 土壤微生物群落功能的多样性和稳定性分析 将 1.4 中采集的土壤样品， 进行微生物群落功能多样性和稳定性分析。土壤微生物群落功能多样性采用 Biolog ECO 测定法 15-16。 Biolog ECO 微平板中多底物酶联反应采用每孔的4 平均吸光度值（ Average well color development， AWCD）来描述，计算表达式： A W C D = C R 3 1（ ） （ 1） 公式中 C 代表含底物试验孔

19、的吸光值， R 代表不含底物对照孔的吸光值。土壤群落功能多样性采用培养 Biolog ECO 微平板孔中吸光值 ， 计算土壤微生物群落功能多 样性指数Shannon 指数 （ H） 和 Simpson 指数（ D） 。 H= iip (Ln p ) （ 2） 2=1 iDP （ 3） 公式中 Pi 为第 i 孔相对吸光值（ C-R）与整个微平板相对吸光值总和 (ODi)的比率。 1.6 数据处理 所用数据均为 3 次重复采样的平均值，利用软件 SPSS 21 进行数据统计分析。图表采用Microsoft Excel 2016 和软件 OriginPro 9.0 绘制。 2 结果与讨论 2.1

20、噬菌体分离纯化 经 5 次分离纯化及 加速 宽宿主谱 表达 后 获得 四株裂 性噬菌体。分别是： 单一 攻击 K12的噬菌体 YSZ1；在 YSZ1 基础上 加速 宽宿主谱 表达 得到 能同时攻击 K12 和 PAO1(RFP)能力的多价 噬菌体 YSZ1R； 单一 攻击 PAO1(RFP)的噬菌体 YSZ5；在 YSZ5 基础上 加速宽宿主谱表达 得到能 同时 攻击 PAO1(RFP)和 K12 能力的 多价 噬菌体 YSZ5K。 由图 1 可知 ： 噬菌体 YSZ1和 YSZ5 的噬菌斑呈清晰透明、边缘整齐、无晕环的圆斑，直径约 1 2 mm； 噬菌体 YSZ1R和 YSZ5K 噬菌斑中间

21、透明、四周 无 晕环、直径约 2 3 mm。 图 1 四株噬菌体 噬菌斑形态 Fig.1 Plaques of four phages 2.2 噬菌体形态观察 通过透射电镜观察不同噬菌体形态， 发现噬菌体 YSZ1（图 2 A） 具有清晰 多面体头部，头长径约 95 nm， 横径约 70 nm，尾长约 100 nm； YSZ1R 可 见到球状头部和一条长尾，头长径约 60 nm，横径约 70 nm，尾长约 175 nm（图 2 B） ； YSZ5 可见到形状规则的立体结构头部和一条长尾，头长径约 100 nm， 横径约 70 nm，尾长约 180 nm（图 2 C） ； YSZ5K 可见到椭圆

22、形 头部 及 可收缩的尾鞘，头长径约 110 nm， 横 径约 80 nm， 尾长约 120 nm（图 2 D） 。YSZ1 YSZ 1R YSZ5 YSZ5K 5 根据 国际病毒分类委员会 (The International Committee on Taxonomy of Viruses， ICTV)第九次报告 17，以上四种噬菌体均属于长尾噬菌体科。 图 2 噬菌体的透射电镜观察 （ 50.0 K） Fig.2 Transmission electron micrographs of phage（ 50.0 K） 2.3 噬 菌体核酸产物酶切电泳分析 利 用环境样品病毒核酸提取试剂盒提

23、取噬菌体基因组 ， 并对核酸产物用酶切处理， 由图3 可知： 四株噬菌体均能被 DNase 降解完全（ 4、 8、 B、 F 泳道），而 RNase A 处理核酸均无变化（ 3、 7、 C、 G 泳道），说明四种核酸产物均为双链 DNA13。用限制性内切酶 Hind 对 DNA 进行酶切处理 后， 估算基因组大小（ 2、 6、 D、 K 泳道），四株噬菌体 YSZ1、 YSZ1R、YSZ5、 YSZ5K 基因组分别约为 57 Kb、 54 Kb、 59 Kb 和 51 Kb。 图 3 噬菌体基因组酶切电泳图 Fig3 Electrophorogram of phages genome YSZ1

24、 A 泳道 M1 1 is phage YSZ1 nucleic acid; 5 is phage YSZ1R nucleic acid; 2 3 4 A is phage YSZ5 nucleic acid; E is phage YSZ5K nucleic acid; B C D & K is nucleic acid treated with DNase I enzyme。 YSZ5K D C YSZ5 YSZ1R B 6 2.4 噬菌体 最佳 感 染复数 最佳感染复数是表征噬菌体裂解能力的重要指标。 从表 1 可知：当 MOI=0.001 时噬菌体 YSZ1 子代产出量最高，达到 5.

25、5 108 PFU mL-1，即：噬菌体 YSZ1 的 OMOI 为 0.001；当 MOI=10 时噬菌体 YSZ1R 子代产出量最高，达到 1.8 108 PFU mL-1， YSZ1R 的 OMOI为 10；当 MOI=0.001 时噬菌体 YSZ5 子代产出量最高，达到 5.4 109 PFU mL-1， YSZ5 的OMOI 为 0.001；当 MOI=0.1 时噬菌体 YSZ5K子代产出量最高，达 5.8 106 PFU mL-1， YSZ5K的 OMOI 为 0.1。 表 1 最佳感染复数的测定 Table1 Determination of optimal multiplici

26、ty of infection (OMOI) 试管 Tube 感染复数 MOI (PFU CFU-1) 噬菌体数 No.of phages (PFU mL-1) 细菌数 No.of bacteria (CFU mL-1) 滴度 A Titer A (PFU mL-1) 滴度 B Titer B (PFU mL-1) 滴度 C Titer C (PFU mL-1) 滴度 D Titer D (PFU mL-1) 1 100： 1 1 109 1 107 5.6 106 1.3 108 5.2 108 4.0 105 2 10： 1 1 108 1 107 7.8 106 1.8 108 5.8

27、108 8.1 105 3 1： 1 1 107 1 107 1.6 107 3.2 107 7.2 108 4.5 106 4 1： 10 1 106 1 107 4.1 107 5.7 106 1.8 109 5.8 106 5 1： 100 1 105 1 107 4.8 108 1.1 106 3.2 109 3.4 106 6 1： 1000 1 104 1 107 5.5 108 5.2 105 5.4 109 7.2 105 7 1： 10000 1 103 1 107 7.6 107 4.8 105 2.8 109 2.7 105 注： A： 噬菌体 YSZ1 的滴度 ； B：

28、 噬菌体 YSZ1R 的滴度 ； C： 噬菌体 YSZ5 的滴度 ； D： 噬菌体 YSZ5K的滴度 。 Note： A： Titer of phage YSZ1； B： Titer of phage YSZ1R； C： Titer of phage YSZ5； D： Titer of phage YSZ5K。 2.5 一步生长曲线的绘制 潜 伏期是指从噬菌体侵染宿主细菌到细菌开始裂解时为止的周期；爆发期是指从 细菌 裂解开始到所有被感染细菌完全裂解的周期；裂解量 =爆发末期噬菌体滴度 /感染初期宿主细菌数量 18。 YSZ1 感染宿主菌的潜伏期为 13 min，爆 发期为 47 min， 裂

29、解 量为 365（图 4 A）；YSZ1R 感染宿主菌的潜伏期为 20 min，爆发期为 51 min， 裂解 量为 47（图 4 B）； YSZ5 感染宿主菌的潜伏期为 12 min，爆发期为 49 min， 裂解 量为 418（图 4 C）； YSZ5K 感染宿主菌的潜伏期为 18 min，爆发期为 42 min， 裂解 量为 24（图 4 D）。由此可知，四株噬菌体的潜伏期和爆发期相对较短，具有潜在的修复应用价值。 0 10 20 30 40 50 60 70 80 905. 56. 06. 57. 07. 58. 08. 59. 09. 510. 0YSZ 1噬菌体滴度Phage ti

30、terlg(PFU mL-1)时间 Time (mi n)(A)0 10 20 30 40 50 60 70 80 905.56.06.57.07.58.08.59.09.510 .0YS Z 5噬菌体滴度Phage titerlg(PFU mL-1)时间 Time ( min )(C)0 10 20 30 40 50 60 70 80 905.56.06.57.07.58.08.59.09.510 .0(B)YS Z 1R时间 Time (mi n)噬菌体滴度Phage titer lg(PFU mL-1)0 10 20 30 40 50 60 70 80 905.56.06.57.07.5

31、8.08.59.09.510 .0Tim eYSZ 5K 噬菌体滴度Phage titerlg(PFU mL-1)时间 Time (mi n)(D)7 0 2 4 6 8 10 128.89.29.610.010.410.811.211.612.0(A)细菌数量Amount ofbacterialg(CFU mL-1)时间 Time (h our)E.c oil K12E.c oil K12 + YSZ 10 2 4 6 8 10 128.89.29.610.010.410.811.211.612.0细菌数量Amount of bacterialg(CFU mL-1)时间 Time (h ou

32、r)P.Aer ugin osaP.Aer ugin osa+ YSZ 5( B )图 4 噬菌体一步生长曲线 Fig.4 One step growth curve 2.6 专一型 噬菌体对单一宿主菌的灭活能力 对上述分离得到的两株 专一型 裂解 性 噬菌体 在水相中 进行灭活能力验证 实验 。由 图 5 A可知 ： 单独添加噬菌体 YSZ1，能显著抑制 K12 生长 （ p 0.05） ；相较于对照组 K12 的生长曲线，添加噬菌体 YSZ1 培养 12 h 后， K12 数量 下降 到 8.9 个数量级 。此外 ， 由 图 5 B可知 ： YSZ5 对 PAO1(RFP)也具有显著 的

33、灭活 作用 （ p 0.05） ， 相较于对照组 PAO1(RFP)的生长曲线，添加噬菌体 YSZ5 培养 12 h 后， PAO1(RFP)下降 到 9.2 个 数量级。 图 5 噬菌体灭活能力 Fig.5 Inactivation ability of phage 2.7 水相中检验噬菌体疗法灭活混合 病原菌 的效果 为了探究噬菌体靶向灭活 病原菌 的能力，本研究将上述获得的 四 株噬菌体添加到 K12和 PAO1(RFP)的混合菌液中，并测定其细菌 数量衰减 变化。由图 6 A 可知 ： 专一型 噬菌体 YSZ1对 K12 的灭活效果非常显著（ p 0.05），与原始 CK 相比 ， K

34、12 下降约 1.5 个数量级；而PAO1(RFP)呈现 先快速增 长 ， 28 h 后 再 缓慢下降的趋势，下降 了 约 0.5 个数量级，这可能是 由于 专一型 噬菌体 YSZ1 在混合 病原 菌体系中，优先攻击 K12 宿主菌，随着共培养的自然进化过程，逐渐形成并具备了一定攻击 PAO1(RFP)的能力 12。处理 2（图 6 B） 中 添加了 多价 噬菌体 YSZ1R 之后， K12 生长抑制率相较于图 6 A 结果略有下降，下降 了 约 1.1 个数量级；而 PAO1(RFP)生长抑制率则相较于图 6 A 结果出现一定程度的上升， 整体 下降 了 约 1.0 个数量级。处理 3（图

35、6 C） 中 ， 添加了专一型噬菌体 YSZ5 之后 ， PAO1(RFP)数量呈现显著下降的趋势（ p 0.05），下降 了 约 1.9 个数量级，同样 K12 在 0 24 h 期间出现稳定 增 长后，呈下降趋势，截止 48 h 时，共下降了约 0.4 个数量级，这 可能 是由于 随 混合 体系中宿主密度增加噬菌体的同时具备较高的吸附速率， 其中 部分 YSZ5 噬菌体 也 进化出 攻击 K12 的 广谱灭活能力 12,19。 处理 4（图 6 D） 中 ， 多价 噬菌体 YSZ5K 对 K12 和 PAO1(RFP)的协同灭活效果相较于其他三组处理，最为显著（ p 0.05）， K12

36、下降约 1.0 个数量级， PAO1(RFP)下降约 1.7个数量 级。由此可知， 多价 噬菌体 YSZ5K 相对其他 种类 噬菌体灭活效果具有更加广谱性的捕食范围， 可 为后续靶向灭活污染土壤中复合 病原菌 的修复技术研发，提供高效的噬菌体菌种资源。 8 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 488. 08. 59. 09. 510. 010. 511. 011. 512. 0细菌数量Amount ofbacteria lg(CFU mL-1)时间 Time (h our)处理 3 Tr eatme nt3E.c oil P.Aer ugin osa ( C )图

37、 6 混合菌悬液中不同种噬菌体灭活效果 Fig.6 Inactivation effect of different phages in mixed bacteria suspension 2.8 噬菌体疗法灭活污染土壤中复合病原菌的验证研究 在病原菌复合污染土壤中，病原菌丰度的变化是决 定土壤污染程度和修复效果的重要参考。本研究中使用的土壤样品采集自奶牛场牛粪堆积池附近的污染土壤，其中多种病原菌的背景丰度较高，在培养 24 天时， 粪肠杆菌（ Fecal Coliform）细菌丰度 为 8.2106 CFU mL-1，假单胞菌属（ Pseudomonas）细菌丰度 为 6.8105 CFU

38、mL-1（图 7 A）。在第 24 天时，处理1 中 专一型 噬菌体 YSZ1 对土壤中粪肠杆菌系列病原菌的灭活效果高于假单胞 菌 属 的相应灭活效果。在该处理中， 粪肠杆菌细菌丰度下降到 8.7105 CFU mL-1，而假单胞菌属细菌 丰度下降 到 6.1104 CFU mL-1，这一结果可能是由于在实际污染土壤中， YSZ1 也逐渐进化出针对 PAO1 的协同灭活能力 12；处理 2（图 7 B）中， 多价 噬菌体 YSZ1R 对两类病原菌都有明显的灭活 能力 （ p 0.05），粪肠杆菌细菌丰度下降到 9.6105 CFU mL-1，假单胞菌属细菌丰度下降 到 3.2104 CFU m

39、L-1；处理 3（图 7 C）中， 专一型 噬菌体 YSZ5 对于假单胞属细菌的灭活效果呈现整体呈下 降趋势，在第 24 天时已下降到 1.8104 CFU mL-1，而对于粪肠杆菌细菌的灭活影响，则呈现出 0 15 天之内略有升高，第 15 天后逐渐下降，第 24 天下降到 2.2106 CFU mL-1；处理 4（图 7 D）中， 添加了 多价 噬菌体 YSZ5K 之后， 粪肠杆菌 细菌和假单胞属细菌丰度均呈现下降的趋势，第 24 天 ， 粪肠杆菌 细菌丰度下降到 6.5105 CFU mL-1；假单胞属细菌丰度下降到 1.2104 CFU mL-1。 多价 噬菌体（ YSZ1R/YSZ5

40、K）对污染0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 488. 08. 59. 09. 510. 010. 511. 011. 512. 0细菌数量Amount ofbacteria (CFU mL-1)时间 Time (h our)处理 2 Treatment 2E.c oil P.Aer ugin osa ( B )0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 488. 08. 59. 09. 510. 010. 511. 011. 512. 0细菌数量Amount ofbacteria lg(CFU mL-1)时间 Time (h our)CKC

41、K -E.coil CK- P.Aer ugin osa处理 1 Tre atm ent1E.c oilP.Aer ugin osa (A)0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 488. 08. 59. 09. 510. 010. 511. 011. 512. 0细菌数量Amount ofbacteria lg(CFU mL-1)时间 Time (h our)处理 4 Tr eatment 4E.c oil P.Aer ugin osa ( D )9 0 24 48 72 96 120 144 168 1920. 00. 10. 20. 30. 40. 50. 60

42、. 70. 8颜色平均变化率Average Well Color Development（AWCD）时间 Time (hou r)对照 CK处理 1 Tr eantm ent1处理 2 Tr eantm ent2处理 3 Tr eantm ent3处理 4 Tr eantm ent4土壤中复合 病原菌综合协同灭活能力均显著高于专一型噬菌体 （ YSZ1/YSZ5），并且噬菌体YSZ5K 在实际污染土壤中的灭活效果要大于噬菌体 YSZ1R 的相应 灭活 效果 。上述灭活土壤中复合 病原菌 的效果趋势与水相中相关验证结果规律一致，尽管灭活土壤中 病原菌 群的效果略低于纯水相中的效果，这可能是由于实

43、际污染土壤中不仅存在复合 病原菌 群，同样也存在大量益生菌群，抵消或削减了实际土壤灭活修复的效果 20-21。 然而，该结果仍然对于靶向修复高丰度病原菌污染土壤具有显著的 指示 意义 。 图 7 污染土壤中 粪肠杆菌 和假单胞菌属细菌丰度的动态变化 Fig.7 The dynamic of Fecal coliform and Pseudomonas bacterial abundance in contaminated soil 2.9 噬菌体疗法 对 土壤微生物群落多样性 的影响 噬菌体疗法 在 靶向灭活土壤中复合 病原菌 的同时，可能也会对土壤其他益生菌群或整体微生物群落结构和 功能 多

44、样性造成一定程度的影响 22。因此，对 施用 过噬菌体 疗法 的污染土壤进行生态风险评估十分必要。 AWCD 数值的变化 可以反应土壤 微生物整体代谢活性 的波动 ； Shannon（ H） 丰富度指数反应的是 群落的丰富 度 , 其值越大说明群落多样性越高 ；Simpson（ D） 指数可反映土壤微生物群落常见种的优势度变化 , 数值越大表明得到同一物种的几率越大 , 其 微生物多样性越低 。 图 8 不同处理方式下 AWCD 值 的变化 0 3 6 9 12 15 18 21 2445678910处理 4 Tr e atm e n t4Feeal ColiformPseudomona s细

45、菌数量Amount ofbacteria lg(CFU mL-1)时间 Time (h our)( D )0 3 6 9 12 15 18 21 2445678910细菌数量Amount ofbacteria lg(CFU mL-1)时间 Time (h our)CKCK- Fecal Co li fo rmCK -Pseud o mo na s处理 1 T reat ment1Fecal Co li fo rmPseudo mo na s(A)0 3 6 9 12 15 18 21 2445678910处理 2 Treatment 2Fecal ColiformPseudomona s细菌数

46、量Amount ofbacteria lg(CFU mL-1)时间 Time (h our)(B)0 3 6 9 12 15 18 21 2445678910处理 3 Treatment 3Fecal ColiformPseudomona s细菌数量Amount ofbacteria lg(CFU mL-1)时间 Time (h our)(C)10 Fig.8 Variation of AWCD value 如图 8 所示， 0 120 h 内 AWCD 值快速增长，进入对数增长期 ； 在培养的 120 h 后，AWCD 值随培养时间的延长趋于缓慢并达到稳定。 AWCD 值在 0.1 0.7

47、之间， AWCD 值表现为 YSZ5KYSZ1RCKYSZ5YSZ1。 此外， 从表 2 可知 ： 不同处理之间， 多价 噬菌体的丰富度指数（ H）显著高于单一性噬菌体的丰富度指数，而优势度指数（ D）则为 多价 噬菌体 处理 显著低于 专 一型噬菌体 处理 （ p 0.05） 。 在这些指数的变化过程中均具有类似规律，即 分别 单独添加 多价 噬菌体 YSZ5K 处理 和 YSZ1R 处理 ， 均可 在一定程度上显著 促进 修复后土壤微生物功能多样性和稳定性 （ p 0.05），而 分别 单独添加 专一型 噬菌 体 YSZ5 处理和 YSZ1 处理，土壤微生物多样性出现了一定程度的降低 。

48、表 2 不同处理方式土壤微生物群落功能多样性指数 Table.2 Diversity indices of soil microbial communities 处理 Treatments 丰富度指数 Shannon（ H） 优势度指数 Simpson（ D） CK 4.2120.32 b 0.780.02 b YSZ1 1.6440.12 d 0.980.03 a YSZ1R 5.2610.45 a 0.510.02 c YSZ5 3.6970.21 c 0.810.02 b YSZ5K 5.4020.61 a 0.480.01 c *不同字母 代表显著性差异 p 0.05. Note: Different letters represent significant difference at 0.05 level. 由此 说明： 多价 噬菌体疗法对于维持或改善土壤微生物群