1、薄层色谱方法总结,1.方法原理,A. 流动相利用毛细管力带着样品穿过固定相。B.样品与固定相的相互作用是指组份在移行过程中由于偶极 - (诱导) - 偶极相互作用,氢键和范德华力的作用而产生不同程度的延缓、吸附、分散、离子交换和络合等分离机理。,2.溶剂,使用的溶剂必须是“分析纯”或“色谱纯”,溶剂组成采用体积量比(如正丁醇 - 冰乙酸 - 水= 4:1:1,V/V/V),或者绝对量(如18ml 甲苯 + 2 ml 甲醇)。其总量应足以使TLC/HPTLC 板的浸入深度约为5mm。展开剂要求新鲜配制,不要多次反复使用,如需分层,则按要求放置分层后取需要的一相(上层或下层),备用。,一、溶剂选择
2、规则,二、展开剂的选择条件,1.对所需成分有良好的溶解性2.可使成分间分开3.待测组分的Rf在0.2-0.8之间,定量测定在0.3-0.5之间4.不与待测组分或吸附剂发生化学反应5.沸点适中,黏度较小6.展开后组分斑点圆且集中7.混合溶剂最好用新鲜配制,三、溶剂极性参数表,环已烷 :-0.2、石油醚(类,3060)、石油醚(类,6090)、正已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯:2.5、苯:2.7、二氯甲烷:3.1、异丙醇:3.9、正丁醇:3.9、四氢呋喃:4.0、氯仿:4.1、乙醇:4.3、乙酸乙酯:4.4、甲醇:5.1、丙酮:5.1、乙腈:5.8、乙酸:6.0、水:10.2,1.,一般说,弱
3、极性溶剂体系的基本两相由正己烷和水组成,再根据需要加入甲醇、乙醇、乙酸乙酯来调节系统的极性,以达到好的分离效果,适合于生物碱、黄酮和萜类等的分离。,2.,中等极性的溶剂体系由氯仿和水基本两相组成,由甲醇、乙醇、乙酸乙酯等来调节,适合蒽醌、香豆素,以及一些极性较大的木脂素和萜类的分离。,强极性溶剂,由正丁醇和水组成,也靠甲醇、乙醇、乙酸乙酯等来调节,适合于极性很大的生物碱类化合物的分离。,四、展开剂的选择,物质分子化学结构中,通常由较极性部分和非极性部分两部分。例如下面以苯丙烷为极性小部分,随着极性基团部分的增加,总体的极性就增加,展开剂极性也增加了。,1.类极性较小的挥发性物质,冰片:石油醚(
4、3060)醋酸乙酯(17:3) 厚朴酚:苯醋酸乙酯(9:1.5)丹皮酚:环己烷醋酸乙酯(3:1) -香附酮:苯醋酯乙酯冰醋酸(92:5:5),结论:以石油醚、正构烷和苯为体积百分数比较大的溶剂,通常起溶解和分离化合物的作用,而用醋酸乙酯为调节Rf(比移值)的溶剂。为了减少拖尾之类其他相似相溶原则以外的影响,适当加入添加剂,如有机酸或者有机碱。,2.类极性较小的不挥发性物质, -谷甾醇:环己烷醋酸乙酯甲醇(6:2.5:1)或者环己 烷丙酮(5:2)、熊果酸:甲苯醋酸乙酯冰醋酸(12:4:0.5)、 齐墩果酸:氯仿甲醇(40:1)、猪去氧胆酸:氯仿乙醚冰醋酸(2:2:1)、 大黄素:苯醋酸乙酯甲醇
5、(15:2:0.2)或者苯乙醇(8:1)、丹参酮A:苯-醋酸乙酯-甲酸(40:25:4)、 穿心莲内酯:氯仿-无水乙醇(9:1)靛玉红、靛蓝氯仿乙醇(9:1)或者苯氯仿丙酮(5:4:1),结论:这类物质展开剂极性比极性较小的挥发性物质洗脱力强一些,因为这类物质极性小的母核大,而极性大的基团通常可以形成氢键,比如羧酸、羟基。以上物质,母核分子量减小、母核结构中不饱和健的增加(尤其是出现苯环),极性基团的增加,都使极性增加,展开剂极性也增大。这个范围内的物质很多,一般展开剂大百分数的溶剂可以从环己烷甲苯二甲苯苯氯仿的顺序,按照极性要求选择。这里注意,异丙醇、正丁醇极性指数也比较小,在这范围的化合物
6、很少用,因为粘性大、展开慢,造成斑点扩散;另外,羟基的氢键作用力也有不利。调节Rf值的溶剂,从醋酸乙酯甲醇丙酮乙醇。挥发性物质也有很多带羰基、羟基的,但从它的挥发性就可以明白,分子间作用力不强,另外,母核与石油醚、正构烷和苯的结构差异小,估计更容易脱离硅胶吸附,更快进入溶剂中,而不需要通过提高展开剂的极性。,3.类极性大的小分子有机酸,结论:这类物质多数是苯乙烯母核的,这个结构的极性本身比较大,另外有酚羟基和羧酸基团,个别有多羟基配基。皂苷的展开剂差不多,极性大。注意甲酸通常指的是浓度85%左右的,含有水。,没食子酸:氯仿醋酸乙酯甲酸(5:4:1)、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、绿原酸、异绿原酸。例
7、如下面以苯丙烷为极性小部分,随着极性基团部分的增加,总体的极性就增加,展开剂极性也增加了。依次为肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、绿原酸。相应展开剂分别为:正己烷乙醚冰醋酸(5:5:0.1)、苯冰醋酸甲醇(30:1:3)、氯仿甲醇甲酸(9:1: 0.5)、石油醚乙酸乙酯甲酸(3:6: 1)、醋酸丁酯甲酸水(7:2.5:2.5)。,4.类含氮有机物,结论分析:由于NH2硅醇基的作用很强,在强极性展开剂加有机酸、有机碱扫尾。对于极性化合物,使用正丁醇对斑点扩散影响较小,因为化合物和硅胶的作用强。,盐酸小檗碱:苯醋酸乙酯甲醇异丙醇浓氨试液(12:6:3:3:0.6)(氨蒸气饱和)或正丁醇冰醋酸-水(7
8、:1:2)、麻黄碱:氯仿甲醇浓氨试液(20:5:0.5)或正丁醇冰醋酸水(8:2:1)甘草酸铵:醋酸乙酯甲酸冰醋酸水(15:1:1:2)。,五、TLC的通用显色方法,1、紫外照射法:方便、不破坏样品; 2、碘蒸气法:通用性强,与紫外法结合灵敏度高于该两法单独使用; 3、荧光试剂:制造荧光背景,使原来紫外下无荧光物质被鉴别,有荧光物质更明显; 4、硫酸溶剂:对绝大多数有机物有效,但有破坏性。,六、薄层层析和纸色谱操作注意事项,1、点样 点样器点样于薄层板上,一般为圆点,点样基线距底边1.01.5cm,样点直径一般不大于2mm,点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。若因样品溶液太稀,可重复点样
9、,但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样,以防样点过大,造成拖尾、扩散等现象,而影响分离效果。点样时必须注意勿损伤薄层表面,2、展开 将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中,浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜,密封,待展开至规定距离(一般为815cm),取出薄层板,晾干,待检测。注:展开缸如需预先用展开剂预平衡,可在缸中加入适量的展开剂,密闭,一般保持1530分钟。,3、显色与检视 供试品含有可见光下有颜色的成分可直接在日光下检视,也可用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色,或加热显色,在日光下检视。有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在356nm紫外光灯下观察荧光色谱。对于可见光下无色,但
10、在紫外光下有吸收的成分可用带有荧光剂的硅胶板(如GF254板),在254nm紫外光灯下观察荧光板面上的荧光猝灭物质形成的色谱。,理想的显色希望灵敏度高,斑点颜色稳定、斑点与背景间的对比度好,斑点的大小及颜色的深度与物质的量成正比,在样品组成并不完全已知的情况下,通用显色方法显得尤为重要,通常显色方法主要有:,1.紫外照射法:方法、不破坏样品2.碘蒸气法:通用性强,与紫外法结合灵敏度高于该两法单独使用3.荧光试剂:制造荧光背景,使原来紫外下无荧光物质被鉴别,有荧光物质更明显,四种体系展开剂,PE(60-90),EtAc/AcOH/n-Butanol/H2O2:1:1:1,EtAc/PE=1:2,EtAc/PE/AcOH15:5:1,展开剂,展开剂选择的大概原则,选择展开剂一般要用混合溶剂:一般要有一种对所要展开样品溶解度较大的溶剂,视样品的极性,再选用相应的体系。,极性小的用乙酸乙酯:石油醚极性较大的用甲醇:氯仿系统极性大的用甲醇:水:正丁醇:醋酸系统拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸,TLC中样品拖尾现象是什么原因?该如何解决?,关于TLC二次展开,是在第一次展开显色后再继续第二次展开,还是在第一次展开后,换另一种展开剂接着展开?,有些问题:,薄层板为什么会裂口和有凹槽?,Thank You!,