1、 - 1 - 50种中药对温和气单胞菌的体外抑菌试验 专业： XXXXXXXXXX 学号： XXXXXX 姓名： XXXXXXXXX 指导教师： XXXXXXX 摘要： 用琼脂扩散法 (打孔法 )测定了鸡血藤等 50 种中药对温和气单胞菌 (Aeromonas sobria)的抑制作用，并用二倍稀释法测定有较强抑菌效果的 26 种中药对温和气单胞菌的最小抑菌浓度 (MIC)和最小杀菌浓度 (MBC)。结果显示大部分中药对温和气单胞菌有抑制作用，木瓜和玫瑰花的抑杀效果最好，其抑菌圈直径达20 mm 以上，其中木瓜的 MIC 和 MBC 相同，为 7.81 mg/ml，玫瑰花的 MIC 为 7.8
2、1 mg/ml ， MBC 为 15.63 mg/ ml；儿茶、白芍等 5 种中药有中等强度的抑菌和杀菌效果 ;薄荷、远志等 4 种中药的抑菌强度弱 ;而柴胡、茵陈等 39 种中药无抑菌作用。 关键词： 温和气单胞菌 ； 中药 ； 免疫防治 ； MIC； MBC 温和气单胞菌 (Aeromonas sobria)，又称威隆气单胞菌 (A Veronii)，属于弧菌科（ Vibrionaceae）气单胞菌属，广泛生活于海水、淡水、污水、土壤中，营腐生，能引起水生生物腹泻、败血症等疾病，是危害我国淡水养殖业的 重要病原菌之一。同时也能引起爬行类、两栖类等冷血动物的出血性败血症 1,2 。同时，该菌
3、也是重要的人畜共患病的病原菌，能引发腹泻、伤口感染和败血症等症状 3 。 传统治疗细菌性疾病的最常用药物是抗生素和合成抗菌药，但其会产生耐药性、药物残留等缺陷，同时国际上对抗生素在水产养殖中的使用也开始有所限制。由于水产养殖中抗生素的使用缺陷及其受到的限制，探讨中药对各种致病菌的抑制作用及其机制变得越来越重要 4 。 与抗生素相比，中药在动物体内不蓄积、无残留，而且，由于中药成分复杂，病原微生物不易对中药产生耐药性 ，提高了其抗菌效力 5 。中药是天然药物，具有毒性低、易降解、安全环保等特点，含抑菌物质，可有效抑制细菌生长 6 甚至杀死细菌 ,有些中药还具有免疫增强作用，使得中药在水产养殖动物
4、的防治抗病方面展现出越来越广阔的前景 4 。由于不同的中药对不同的细菌的抑制作用不同，同种中药的不同浓度对同种细菌的抑制作用也不同，所以需要进行试验筛选出抑菌作用最强的中草药，以便为生产实践提供依据。本次试验广泛选取了 50 种中药对温和气单胞菌进行体外抑菌试验，以期为实际生产中由温和气单胞菌引发的常见疾病的防治提供参考。 - 2 - 1 温和气单胞菌对渔业的危害 近几十年来，我国淡水养殖业发展很快，尤其是特种的水产发展，随之而来的疾病给淡水养殖业带来巨大的经济损失 6-9。而在淡水养殖病害中，温和气单胞菌占有重要位置，致病力甚至强于嗜水气单胞菌 10。淡水鱼类的细菌性败血症也被称为细菌性出血
5、症、出血症、出血性腹水病、腹水病等，该病是我国水产养殖历史上危害鱼类多，受害鱼类规格范围大，流行区域广、季节长，造成的经济损失大的一种急性传染病。病症主要表现为，发病初期，病鱼的上下颌、口腔、鳃盖、体侧和鳍条基部轻度充血，肠内有少量食物。发病严重时， 病鱼体表充血严重甚至出血，眼眶周围发红充血而出现突眼现象，全身肌肉充血呈红色。肛门红肿，腹部膨大，腹腔内有淡黄色透明或是血红色浑浊的腹水，肝、脾、肾肿胀，肠膜及肠壁充血，空肠，肠内充气且有大量粘液，部分鱼鳃器官色浅，呈贫血症状。主要发病在一冬龄的鱼种和成鱼；流行水温以 28-32 为高峰，6-7 月份易急性暴发。严重时其发病率高达 100，死亡率
6、可达 90以上。苏应兵等人从表现出血症状的患病斑点叉尾鮰体内分离出病菌，测定结果显示致其急性死亡的致病菌为温和气单胞菌。张晓君等人从患细菌性烂鳃病的草鱼体内分离出了温和 气单胞菌和豚鼠气单胞菌，其中温和气单胞菌占占主导地位 15。 同时，随着养鳖业规模的扩大及集约化养殖的普及，鳖病的发生率越来越高，危害日益递增，其中以气单胞菌引起的危害最为严重，能引起鳖的赤斑、红脖子、出血性肠坏死、穿孔、腐皮、疖疮、白点等多种病症，导致的死亡率高达 80，严重制约养鳖业的顺利发展 10-12。 2 温和气单胞菌的防治 2.1 中药防治 2.1.1 防治优势 随着水产养殖业的迅速发展，病原菌的抗药性尤其是多重耐
7、药性日益严重，导致临床上使用的抗菌药物难以达到治疗疾病的目的，给水产养 殖业带来不同程度的损失。使用抗菌中药及其制剂来防治鱼类细菌性疾病是一个比较理想的手段。中药是天然绿色植物，作为我国特有的中医理论与实践的产物，以扶正祛邪、标本兼治著称，兼有营养和药用双重作用，可以有效抑制甚至杀灭细菌同时增强机体免疫力，还能促进营养物质消化吸收，此外值得一提的是，中药在机体内无残留，不会使致病菌产生耐药性。 孙红祥等人报道的由多味中药材加工研制而成的复方制剂鳖保宁，对鳖病害有显著- 3 - 防治疗效。体外抑菌试验结果表明，鳖保宁及其相关单味药对养殖鳖主要病原菌温和气单胞菌有一定的抑制和杀灭作用。其中，鳖 保
8、宁的作用最强，明显高于单味药 10。 2.1.2 有效成分及防治机理 中药对细菌之所以有抑菌作用是由于其内含有某些抑菌成分，主要包括生物碱类、甙 类、挥发油类、鞣质、黄酮类、油脂类、树脂、有机酸、色素、氨基酸、多糖类以及萜类等。如玫瑰花含有多酚类、黄铜类多种化学成分 19-20。这些化学成分有减少和消除自由基、抗氧化活性、抗血栓、抗癌、抗炎、抑菌、降血脂、免疫调节作用 21-22。木瓜果实主要含有黄酮类、有机酸类、三萜类、皂角类、糖类、酚类、鞣质等 23-24。这些化学物质有抗凝血、抑感染、御放射、 抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老等作用 25。其中鞣质类特别具有收敛作用，能使皮肤黏膜、溃疡等局部
9、蛋白质凝固；能加速血液凝固而达到止血的目的；能沉淀生物碱，对生物碱中毒有解毒作用。黄酮类具有消除活性氧自由基，防止生物膜脂质被超氧自由基和羟自由基氧化的功能，在抗氧化、抗癌、放肿瘤方面有明显作用。萜类化合物具有消炎、清除自由基、抗突变、抑菌、抗肿瘤、增强免疫力、降转氨酶、纠正体内异常蛋白代谢、防止肝硬化、降血脂、降血糖等作用。多糖类具有抗凝血、抑感染、御放射、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老等作用。 2.1.3 应用 前景 中药在水产养殖中有防治疾病、增强免疫力、促进生长、提高饲料报酬、提高成活率、促进繁殖、作诱食剂、改善水产品、减少应激、增加动物的耐受力、防霉防腐等作用 16-18。此外，中药具
10、有标本兼治的特性 ,这一优势契合了中医所说 “ 药有个性之特长，方有合群之妙用 ” 的精髓。更重要的是，中药治疗水产动物疾病不会引起药物残留和耐药菌株的产生，因而具有广阔的应用前景。 2.2 其他控制手段 温和气单胞菌在水和土壤中广泛分布，主要宿主是冷血动物。故此病的关键是预防，即加强对养殖用水的消毒净化以杀灭病原。故平 时要定时清塘；选用健壮亲鱼进行繁殖，并严禁近亲繁殖；加强饲养管理，采用生物、物理、化学、等方法保持优良水质及底质；投喂优质饲料，提高鱼体抗病力；食场周围定期泼洒消毒液进行消毒；加强巡塘工作，每月对鱼进行抽样调查 1-2 次，发现病情及时进行防治；在该病流行季节，定期用显微镜检
11、测鱼体，杀灭鱼体外寄生虫；发病池用过的工具要进行消毒，病死鱼要及时捞出深埋，不能到处乱扔等。 在使用各种药物进行温和气单胞菌病的预防和治疗过程中，我们还应当重视生态养- 4 - 殖。生态养殖不仅能充分利用水体，提高综合效率，而且可以改善养殖水体水质，有 效地预防水产病害的发生，从而减少渔药的使用量。另一方面，我们也要加快生物渔药的研制，利用争夺水生病原微生物的栖息条件，破坏病原微生物的繁衍，以及直接吞噬病原微生物或与其进行种间的生存竞争，来达到控制水产病害的目的 13。 3 材料与方法 3.1 材料 3.1.1 菌株 试验用温和气单胞菌为本实验室保存菌株。 3.1.2 实验药物 50 种中药
12、(如表 1 及图 1 所示 )，购于 四川省宜宾市老百姓 大药房。 3.1.3 培养基 本试验采用 pH 为 7.2-7.4 的普通酵母培养基，其液体培养基配方为：蛋白胨 10 g、酵母 5 g、氯化钠 5 g、水 1000 ml。固体培养基为每 100 ml 液体培养基加入 2 g 琼脂。 表 1. 中药名录 Tab. 1 Tested Chinese herbal medicines 中药 科名 产地 药用部位 拉丁名 鸡血藤 艾叶 陈皮 北豆根 玫瑰花 薄荷 大枣 紫苏 牡丹皮 茯苓 远志 天冬 地黄 豆科 菊科 芸香科 防己科 蔷薇科 唇形科 鼠李科 唇形科 毛茛科 多孔菌科 远志科
13、百合科 玄参科 广西 四川 湖北 河北 四川 四川 河南 四川 四川 湖北 山西 贵州 河南 藤茎 叶 橘皮 根茎 花蕾 茎叶 果实 茎叶 根皮 白茯苓 根 块根 根 Millettia dielsian Artemisia argyi Pericarpium Citri Rhizoma Menispermi Rosa rugosa Herba Menthae Fructus Jujubae Perilla frutescens Cortex Moutan Poria Radix Polygalae Asparagus cochinchinensis Rehmannia - 5 - 薏仁 姜黄
14、 牛膝 金银花 石韦 栀子 山楂 桑叶 漏芦 降香 柴胡 决明子 石菖蒲 大蓟 木香 玄 参 何首乌 侧柏叶 五加皮 茵陈 鱼腥草 泽泻 重楼 山慈菇 银杏叶 青黛 木通 川芎 白芍 禾本科 姜科 苋科 忍冬科 水龙骨科 茜草科 蔷薇科 桑科 菊科 豆科 伞形科 豆科 天南星科 菊科 菊科 玄参科 蓼科 柏科 五加科 菊科 三白草科 泽泻科 百合科 兰科 银杏科 爵床科 木通科 伞形科 毛茛科 贵州 四川 河南 四川 湖北 四川 河北 四川 湖北 广东 湖北 四川 四川 四川 云南 四川 四川 四川 吉林 四川 四川 四川 云南 四川 山西 福建 四川 四川 安徽 成熟种仁 根茎 根 花 叶片
15、 成熟果实 成熟果实 叶 根 心材 茎叶 成熟种子 花、叶 根 根 根 块根 叶 根皮 干 燥幼苗 地上部分 块根 根茎 假鳞茎 叶 茎、叶 果实 根茎 根 Semen Coicis Rhizoma Curcumae Achyranthes bidentata Flos Lonicerae Folium Pyrrosiae Fructus Gardeniae Fructus Crataegi Folium Mori Radix Rhapontici Lignum Dalbergiae Root of Chnese Catsia tora Acorus gramineus Herba seu R
16、adix Common Vladimiria Figwort Root Fallopia multiflora Platycladus orientalis Cortex Acanthopanacis Herba Artemisiae Herba Houttuyniae Rhizoma Alismatis Rhizoma Paridis Cremastrae Pseudobulbus Folium Ginkgo Indigo Naturalis Caulis Akebiae Rhizoma Ligustici White Paeony - 6 - 白术 木瓜 穿破石 青蒿 大青叶 威灵仙 明党
17、参 儿茶 菊科 蔷薇科 桑科 菊科 十字花科 毛茛科 伞形科 豆科 四川 四川 四川 四川 四川 四川 河北 湖北 根茎 木材 根 茎叶 菘蓝叶 茎叶 根 去皮枝叶 Atractylodes macrocephala Chaenomeles speciosa Xylosma controversum Herba Artemisiae Folium Isatidis Radix Clematidis Changium smyrnioides Acacia catechu 3.2 试验方法 3.2.1 中药提取液制备 将供试中药置于 60 恒温干燥箱中烘至恒重，然后 各取中药 20 g，加入 20
18、0 ml蒸馏水浸泡 3 h，然后加热至沸腾，沸后文火煮 30 min， 滤出煎液， 共煎煮 3 次，每次加水量 200 ml。合并 3 次药液过滤，将滤液蒸发浓缩至浓度为 1 g/ml， 用 0.5 mol/l 的 NaOH 将药液的 pH 值 调 至中性附近，倒入 EP 管 中 密封 放于 121 高温 灭菌锅灭菌 20 min 后，置于 4 冰箱中保存备用。 3.2.2 培养基制备 制备液体培养基：取蛋白胨 10 g、酵母 5 g、氯化钠 5 g、水 1000 ml 于锥量杯中置于火上，沸后文火煮至液体不再腾出量杯为止，将液体倒入锥形瓶中 密封 ， 121 高温湿热灭菌 20 min 后，
19、置 4 冰箱中保存待用。 固体培养基为每 100 ml 液体培养基加入 2 g 琼脂，制备 方法同液体培养基制法。 - 7 - 图 1 中药 Fig. 1 Chinese herbal medicines 3.2.3 温和气单胞菌菌液制备 将温和气单胞菌菌株划线培养， 28 孵育过夜。取单菌落种于 5 ml 酵母液体培养基中，在恒温摇床中 28 下震荡（ 200 r/min）培养 4 h,然后吸取 200 L 菌液均匀涂布， 28 培养 24 h，洗下菌苔液，用麦氏比浊法测定其浓度，将菌液浓度调整为1.0 108CFU/ml，置于 4 冰箱中保存待用。 3.2.4 测定抑菌效果 参照中药药理实
20、验方法学等文献 32-33 采用平皿打孔法，在超净工作台内，向培养皿（直径为 9 cm）内倒入培养基，每种药液用 3 组 平板作平行试验。 每个平板上加上 200 l 菌液， 用棉签均匀涂抹于固体培养基上，等菌液干后， 去两个平板， 用直径为 6.00 mm 的无菌打孔器在 一 个平板上打三个孔， 另一个平板上打 2 个孔， 其中 一个平板的任意 两个孔 及另一个平板的两个孔 注入 50 l 药液， 其余 一孔注入灭菌 蒸馏水作为对照，标记药物。将平板置于 28 恒温箱中培养 24 h。观察并用游标卡尺测量- 8 - 抑菌圈直径，取平均值作为结果。依照最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的结果，参 照参
21、考文献 34 将中药划分成 4 个等级，分别为：抑菌圈直径小于 10 mm 为无抑菌作用，用 “ -”表示； 10-15 mm 表示抑菌作用弱，用 “+” 表示； 15-20 mm 为中等强度抑菌作用，用 “+ +” 表示；大于 20 mm 为抑菌作用强，用 “+ + +” 表示。 表 2. 中药对温和气单胞菌的抑菌效果 Tab. 2 Antibacterial effect of Chinese herbal medicines on Aeromonas sobria 中药 抑菌圈直径 /mm 抑菌等级 木瓜 玫瑰花 儿茶 白芍 山楂 紫苏 艾叶 薄荷 远志 鸡血藤 牡丹皮 柴胡 茵陈 玄参
22、 银杏叶 降香 威灵仙 决明子 牛膝 五加皮 地黄 20.650.51 20.080.05 16.540.23 15.940.10 14.230.14 13.900.36 13.820.14 10.820.47 10.680.12 10.460.14 10.310.46 9.860.52 9.850.08 9.830.19 9.530.06 9.500.23 9.360.09 9.360.24 9.250.28 9.140.18 9.120.11 + + + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - 9 - 青蒿 栀子 侧柏叶 木香 石韦 重楼 何首乌 天冬
23、陈皮 白术 穿破石 北豆根 大枣 茯苓 薏仁 姜黄 金银花 桑叶 漏芦 石菖蒲 大蓟 鱼腥草 泽泻 山慈菇 青黛 木通 川芎 大青叶 明党参 9.010.15 8.810.17 8.780.61 8.630.34 8.58 8.460.42 8.230.04 8.050.62 8.010.98 7.990.39 7.880.17 6.730.01 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
24、- - - - - - - - - - 10 - 注 ： “+ + +” 表示抑菌作用强， “+ +” 表示抑菌作用中等， “+” 表示抑菌作用弱 ,“ ” 表示无抑菌作用。 3.2.5 测定最小抑菌浓度 (MIC) 采用二倍稀释法 46 测定。在超净工作台内，每种药物准备 11 支灭菌的 5 ml EP 管，编号 1-11 号，每支管中分别加入 1 ml 菌液，向 1 号管中加入 1 ml 中药提取液，混合均匀后吸出 1 ml 加入 2 号管中，同法依次稀释至第 10 号管，弃去 1 ml，第 11 号管作为不加药物只加菌液的生长对照。 使 11支管内中草药液含量分别为： 500、 250、
25、 125、62.5、 31.3、 15.6、 7.81、 3.91、 1.95、 0.977、 0 mg/ml。 每管总量为 1 ml，置于28 恒温箱中培养 24 h。然后观察结果，清澈透明无浑浊现象的 EP 管即为无菌生长管。无菌生长管中的最低药物浓度就是最小抑菌浓度（ Minimal Inhibitory Concentration, MIC）。每种药物重复 3 次，结果取平均值。 3.2.6 最小杀菌浓度的测定 (MBC) 在 MIC 试验基础上，把无菌生长的各管摇动均匀，继续培养 24 h，观察结果 35 ，同理，清澈透明无浑浊的 EP 管为无菌 生长管。无菌生长管中的最低药物浓度为
26、最小杀菌浓度（ Minimal Bactericidal Concentration, MBC）。 表 3. 中药对温和气单胞菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度 Tab. 3 MIC and MBC of Chinese herbal medicines on Aeromonas sobria 中药 MIC/mg.ml-1 MBC/mg.ml-1 木瓜 玫瑰花 儿茶 白芍 山楂 紫苏 艾叶 薄荷 远志 鸡血藤 7.81 7.81 31.25 62.50 62.50 125.00 125.00 250.00 250.00 250.00 7.81 15.63 62.50 62.50 62.50 125.00 125.00 250.00 250.00 250.00
