1、张国军（首都医科大学附属北京天坛医院实验诊断中心） 写在课前的话梅毒是一种慢性、系统性疾病。学员通过本课件的学习，要熟悉梅毒的定义、传播途径及临床分期；掌握不同时期梅毒的治疗方法；掌握梅毒实验室检测方法和梅毒免疫学反应；掌握梅毒血清学实验的原理、特点及各自优缺点；掌握先天性梅毒和神经梅毒的诊断方法。一梅毒概况及临床分期梅毒是由梅毒螺旋体引起的一种慢性、系统性性传播疾病。人体受感染后，螺旋体很快播散到全身，可侵犯全身各组织与器官，临床表现多样，且时隐时显，病程较长。梅毒早期主要侵犯皮肤及粘膜，晚期除侵犯皮肤、粘膜外，还可侵犯心脏血管系统及中枢神经系统等全身各个系统；另一方面，梅毒又可多年无症状而
2、呈潜伏状态。主要传播途径:性接触传染是最主要的传播方式；其次是垂直传播。随着梅毒在人群中流行率升高，母婴垂直传播发生率日益上升，并伴随着包括诊断、治疗、阻断等在内的一系列问题；第三，输血传播。输血传播曾经是梅毒重要的传播方式。但随着血液筛查的广泛开展及输血的减少，梅毒经输血传播已很少发生。但近年来，由于艾滋病的流行，梅毒仍然是输血安全的威胁。临床分期：一期梅毒：主要表现为单个、无痛性的硬下疳，通常在感染梅毒螺旋体后3 - 4 周出现；二期梅毒：一期梅毒不经治疗，梅毒螺旋体在几周到几个月后会播散到血液中，引起二期梅毒。二期梅毒的临床表现多样，常见发热、淋巴结病、弥漫性皮疹、生殖道或会阴湿疣等。一
3、、二期梅毒统称为早期梅毒；三期或晚期梅毒：在最初感染的数年至十数年后发生，可累及任何器官，常见梅毒瘤性梅毒、心血管梅毒以及神经梅毒。隐性梅毒：无症状但梅毒血清学试验呈阳性。分为早期隐性梅毒（病程一般在一年以内）和晚期隐性梅毒（病程一般在一年以上） 。二梅毒的治疗非口服途径的青霉素可用于各期梅毒的治疗。早期梅毒的治疗首选240 万单位苄星青霉素 G 单次肌肉注射。对青霉素过敏者，替代治疗方案有强力霉素，口服，每次100 mg，每日2 次，持续2 周，或四环素，口服，每次500 mg，每日4 次，持续2 周。早期隐性梅毒的治疗方案与早期梅毒相同。晚期隐性梅毒的首选治疗方案为每周一次肌肉注射240
4、万单位苄星青霉素 G，持续3 周；对青霉素过敏者，替代治疗方案有强力霉素，口服，每次100 mg，每日2 次，持续4 周，或四环素，口服，每次500 mg，每日4 次，持续4 周。合并 HIV 感染、梅毒瘤性梅毒、心血管梅毒的治疗方案同晚期隐性梅毒相同。神经梅毒治疗只能采用青霉素，静脉注射水溶性青霉素 G，每4 小时 300 - 400万单位，持续 10 - 14 天，或肌肉注射普鲁卡因青霉素 G，每天240 万单位，持续10 - 14 天，同时口服丙磺舒，每日500 mg，每日4 次，持续10 - 14 天。孕妇的治疗只能采用青霉素，青霉素过敏者需经脱敏后再治疗。早期梅毒应如何治疗？ 三实验
5、室检测暗视野显微镜检查法：是主要的梅毒病原学诊断方法,是最特异的一期梅毒检测方法。取材部位以硬下疳为主，也可从宫颈、阴道、淋巴结等处取材。阳性可确诊，阴性不能排除梅毒（需在3 周内不同的3 天采样检测，才能得出阴性结果） 。暗视野显微镜法诊断的准确性受操作者的经验、病灶中活螺旋体的数量以及口腔、肛门破损处存在的非致病性螺旋体等因素的影响。镀银染色法：与暗视野检查法的临床意义基本相同。该法利用梅毒螺旋体具有亲银性，可被银溶液染成棕黑色，再通过普通高倍显微镜进行观察。直接免疫荧光法（DFA）：是目前国外采用较多的方法，其特异性及敏感性均优于暗视野显微镜检查法。将特异性的抗梅毒螺旋体单克隆抗体用荧光
6、素标记，如果标本中存在梅毒螺旋体，则通过抗原抗体特异性结合，在荧光显微镜下可见到发苹果绿色的梅毒螺旋体。此法可区分梅毒螺旋体和其他非致病性或条件致病性螺旋体。聚合酶链反应（PCR）：能对生殖器溃疡进行早期鉴别诊断，区分梅毒、生殖器疱疹和软下疳。它又可分为 PCR 和 RT-PCR。PCR 的设计主要针对编码梅毒螺旋特异性抗原和 TpN47的DNA 开放编码区，常见的引物有 K03A、K04、47-1、47-2、47-3、47-4等。由于在 PCR 中会偶然出现非特异的 PCR 产物而干扰结果，因此必须用特异性 DNA 探针进行 DNA-DNA 杂交来提高 PCR的特异性及敏感性。此外，由于 T
7、pN47的保守性，雅司螺旋体可产生类似的 PCR 产物，所以这种设计的 PCR 不能区分梅毒和雅司；但可以区分梅毒螺旋体和引博氏疏螺旋体，这就可以解决梅毒与莱姆病之间血清诊断中的免疫交叉的问题。另外一种是 RT-PCR，常见的设计是针对梅毒螺旋体的16s rRNA 366bp 片段，这种方法污染少，特异性敏感性都比较高，但价格也较高。PCR 在梅毒持续感染中的诊断价值目前还没有一致的意见，理论上讲 PCR 可以查出死亡的 TP，所以治疗后 PCR阳性并不意味着治疗失败，但死亡的 TP 从机体内清除比较快（15-30 天） ，而存活的 TP 从机体内清除至少需120天，所以治疗数周后 PCR 阳
8、性意味着持续感染的可能。此外也有将 PCR 用于产前诊断和神经梅毒诊断的报道。四免疫学反应人类对梅毒没 有先天免疫性，尚无疫苗接种进行人工免疫，只能在受感染后产生感染性免疫。已完全治愈的早期梅毒患者仍可再感染。感染梅毒后，首先产生 IgM 型抗梅毒螺旋体抗体，感染2周后可检出，早期梅毒治疗3 - 9 个月或晚期梅毒治疗2 年后，大部分病人 IgM 可转阴，再感染时又出现阳性，所以 IgM 型抗体的存在是活动性梅毒的表现。通常感染梅毒4 周左右产生 IgG 型抗梅毒螺旋体抗体，即使经足量抗梅治疗，梅毒螺旋体抗原消失后很长时间，IgG 抗体仍可通过记忆细胞的作用继续产生，甚至终生在血液中可检到。另
9、一种具有抗体性质的物质叫反应素，是梅毒螺旋体破坏人体组织过程中释放出的一种抗原性心磷脂刺激机体所产生的抗体。反应素一般在感染后5 - 7 周，或下疳出现后2 - 3 周产生，经正规治疗后可以逐渐消失。胎儿在宫内感染梅毒螺旋体后，胚胎的晚期6 - 9 个月时，已能合成 IgM 型抗体，出生后第3个月开始形成 IgG 型抗体；IgM 抗体不能通过胎盘，而IgG 型抗体能通过胎盘，如果在患儿血清中检出 IgM 是诊断先天性梅毒的有力的证据，但 IgM 阴性并不能排除先天性梅毒。五梅毒血清学试验（一）非特异性梅毒血清学试验非梅毒螺旋体抗原血清试验是以心磷脂、卵磷脂以及胆固醇作为抗原检查血清中的反应素，
10、用于初筛试验及疗效观察。有以下四种试验，原理基本相同：性病研究实验室玻片试验（VDRL） 。试剂需现配现用，并且要在显微镜下观察结果，故国内实验室很少采用。但 VDRL 是诊断神经性梅毒最特异的血清学方法。不加热血清反应素试验（USR） 。试剂不需要现配现用，但仍然要在显微镜下观察结果，现在已很少使用。快速血浆反应素环状卡片试验（RPR） 。在特制的纸片上进行，加入一定量特制炭粉，可使抗原抗体出现凝集，用肉眼可观察结果。甲苯胺红不加热血清试验（TRUST） 。在试剂中以红色的甲苯胺红颗粒代替黑色的炭粉颗粒，使结果更容易观察。本试验的缺点：特异性。在多种疾病，如急性病毒性感染、自身免疫性疾病、结
11、缔组织病、肿瘤、静脉吸毒者、老年人以及孕妇中均可出现反应素，所以此类试验有时会出现假阳性；敏感性。感染梅毒后反应素的出现时间晚于特异性梅毒螺旋体抗体，因此非梅毒螺旋体抗原血清试验对一期梅毒的漏检率比较高。RPR 或 TRUST 有时出现弱阳性或阴性结果，而临床的二期梅毒检测需将患者血清稀释后做定量的试验，如果再出现阳性结果，则为抗体过量引起的“钩状效应” ，大约1%-2%的二期梅毒病人可出现假阴性。另外，晚期梅毒反应素转阴率较高，此类试验对隐性梅毒不太敏感，因此此类试验漏检较多。本试验的优点：阳性患者往往是梅毒现症感染者，临床上即可开展治疗；该试验表现为滴度随成功的治疗而逐渐下降，可作为疗效观
12、察的指标；价格低廉。测定非梅毒螺旋体抗原血清试验的滴度进行疗效观察：治疗成功：早期梅毒患者在治疗后6 个月内症状消失，并且非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度有至少4 倍下降。晚期或隐性梅毒患者在治疗后12 - 24 个月内非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度有至少4 倍下降，说明治疗较成功。治疗失败：治疗后症状持续或重新出现；治疗后非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度反而上升4倍或以上；本试验初始滴度比较高（1:32 或以上） ，但在六个月内没有达到4 倍下降。抗梅毒治疗失败的病人应考虑是否有合并 HIV 感染及神经梅毒可能性。血清固定。经正规治疗后，梅毒患者非梅毒螺旋体抗原血清试验一般都会转为阴性，但是有约1%
13、- 3% 的病人即使经足量抗梅治疗，非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度仍然可持续呈低滴度阳性，此现象称为血清固定，原因尚不清楚。血清固定患者的滴度重又上升则提示再次感染梅毒。（二）特异性梅毒血清学试验梅毒螺旋体抗原血清学试验是用梅毒螺旋体作为抗原检测血清当中的抗螺旋体的 IgM 或者 IgG 抗体，其敏感性和特异性均高于非梅毒螺旋体抗原血清试验，但不能用作疗效观察的指标。常用五种方法：荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验；梅毒螺旋体血球凝集试验；梅毒螺旋体明胶凝集试验；梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验；梅毒螺旋体快速诊断试验。1.荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）：是所有螺旋体试验中最敏感的方法，特异性高
14、，通常被认为是检测梅毒的“金标准” 。且该试验可分开检测 IgM 和 IgG。但是该法在技术操作上最困难，试验操作及结果判读都必须核实。试验可靠性的关键是标准化的结果判断、高质量的荧光标记抗体及适当的稀释度。由于实验室操作繁琐及主观判断经常会产生错误的结果，因此增加标记荧光标记染料的复染可以减低标准化过程中的错误，并增加其可读性及重复性。由于该试验需要优质的荧光显微镜和技术熟练的操作人员，所以通常不被临床实验室作为常规方法进行开展。2.梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）：原理是用超声裂解的梅毒螺旋体作为抗原，致敏经醛化、鞣化的羊或禽类红细胞，此致敏红细胞与人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体结合，可
15、产生肉眼可见的凝集反应。TPHA 的优点：该法比 FTA-ABS 容易操作且稳定性好，敏感性除早期梅毒外与 FTA-ABS 相似，对大样本进行批量检测时，操作也较容易。不足：由于红细胞具有生物活性，可能产生非特异性凝集，且保存的时间较短，批间差较大，所以在实际使用当中也存在一些问题。目前国内使用的商品化 TPHA 试剂盒均没有通过国家批批检。3.梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）：原理与 TPHA 的原理基本相同，但它以人工合成的惰性明胶颗粒代替 TPHA 中的红细胞作为载体，是 TPHA 的升级产品。优点：试剂稳定，批间差小；结果判读更为清晰明确；敏感性和特异性较 TPHA 进一步提高；通过
16、了国家的批批检。不足：结果判定主观，较难实现自动化。4.梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）：原理是以梅毒螺旋体抗原包被聚丙乙烯板，再加入待检血清及酶标记抗原，形成双抗原夹心，同时检测 IgG 和 IgM 抗体。少数试剂采用间接法，使用酶标记的抗人 IgG 或 IgM，可分开检测 IgG 和IgM。优点：敏感性和特异性较高；价格低廉，适合大量样品筛查；可实现操作自动化、客观化。缺点：ELISA 试剂盒品牌众多，各家采用的抗原和工艺不同，使敏感性和特异性产生较大差异，临床实验室在选用 ELISA 试剂前要认真评估。酶联免疫吸附试验检测梅毒螺旋体 IgM 抗体。原理：ELISA间接法或捕
17、获法，以捕获法的敏感性和特异性为最佳。由于血液中 IgG 的量远高于 IgM，为避免交叉反应引起假阳性，需对样本进行预处理，事先去除其中的 IgG ，然后再测定 IgM。分离去除 IgG 的常用方法为柱层析法或免疫沉淀法，沉淀剂通常采用抗人 IgG 等。用途：先天性梅毒的诊断；活动性梅毒的诊断及疗效观察；梅毒再感染的诊断。结果解释：IgM 阳性是先天性梅毒或活动性梅毒重要的证据，但是阴性结果并不能排除感染的可能性。5.梅毒螺旋体快速检测试验（TP-RT）：原理是双抗原夹心免疫层析试验或间接法免疫渗滤试验，大多采用胶体金标记，可同时检测 IgG、IgM 抗体（双抗原夹心法） ，或单独检测 IgG
18、抗体（间接法） 。优点是简便、快速，不需要特殊仪器；适合单人份操作，可用于较紧急和实验室条件差的场合。缺点：临床评估资料不多，敏感性、特异性有待考查；无法实现自动化，结果判读主观；测定结果受温度和时间影响较大；没有通过国家的批批检；价格较高。（三）免疫印迹试验梅毒免疫印迹试验（Western blot）与作为 HIV 抗体确认的免疫印迹试验采用相同的原理和技术。既可检测 IgG 抗体，也可以检测 IgM 抗体。目前已经有商品化的试剂盒供应，但价格高昂。检测特异性的梅毒抗体条带，分子量分别为15.5、17、45.5和47 kd。梅毒 IgG 免疫印迹试验的敏感性和特异性均可以达到甚至超过免疫荧光
19、吸附的水平。有文献报道，梅毒 IgM 免疫印迹试验对先天性梅毒的诊断可能很有意义，其特异性至少达到90%，而敏感性可达83% 以上，高于这个荧光免疫吸附试验19S IgM 73%的水平。（四）关于梅毒血清学试验程序的探讨先以非梅毒螺旋体抗原血清试验（RPR 或 TRUST 等）进行初筛，再以梅毒螺旋体抗原血清试验（TPPA、TPHA、ELISA 等）进行确认。该方案优点是非梅毒螺旋体抗原血清试验价格低廉，使梅毒检测成本较低；缺点是非梅毒螺旋体抗原血清试验敏感性比较差，容易出现漏检。同时进行梅毒螺旋体抗原血清试验和非梅毒螺旋体抗原血清试验，优点是技术上的最佳方案，缺点是人力和试剂成本较高。第三个
20、方案是先进行梅毒螺旋体抗原血清试验，阳性时再进行非梅毒螺旋体抗原血清试验。梅毒血清学试验程序可以如何安排？各有哪些优缺点？ 六先天性梅毒的诊断先天性梅毒的诊断要结合临床表现、物理检查、影像检查、血清学检查和直接显微镜检查进行综合判断。先天性梅毒的症状有：鼻音、肝脾肿大、皮肤损伤、骨软骨炎等，50% 的梅毒患儿出生时没有异常表现，多数在 3周至6个月时出现上述症状中的一项或几项，可能更晚出现（出生2年以后） ，特征有畸型、耳聋、失明、弱智等。由于母体的螺旋体直接进入胎儿的血循环，因此先天性梅毒均直接表现为二期梅毒。从脐带、胎盘、新生儿皮损处采样，在显微镜下直接检查到梅毒螺旋体可以确诊先天性梅毒。
21、新生儿梅毒抗体滴度如果高于母亲，也可以诊断为先天性梅毒，这种情况约占先天性梅毒诊断的22%，但相反的情况则不能排除是先天性梅毒。新生儿梅毒特异性 IgM 抗体检测阳性可诊断为先天性梅毒，但阴性不能够排除。从母体被动获得的梅毒 IgG 抗体在新生儿体内代谢、清除需要12 - 18 个月，因此通过随访排除或确诊先天性梅毒的时间为1年半左右。新生儿梅毒特异性抗体检查阳性，同时脑脊液 VDRL 呈阳性或在物理检查中发现有先天性梅毒体征的，也可以推断为先天性梅毒。新生儿梅毒如何诊断？ 七神经梅毒的诊断神经梅毒的发生率在未经治疗的梅毒病人中约为10%。早期梅毒出现神经症状，像痴呆、精神抑郁、共济失调、失语
22、症、反向亢进、人格和认知障碍、视力改变等，或晚期梅毒即使没有出现神经症状，都应该考虑神经梅毒的可能性。单靠实验室检测结果在很多情况下难以明确诊断神经梅毒，必须将临床表现和实验室检测结果结合起来，进行综合的判断。梅毒螺旋体抗原血清试验阴性可以排除神经梅毒，但阳性不能够确诊，需要进一步进行脑脊液检查。TPHA 指数(脑脊液与血清 TPHA 比值)对诊断可能有帮助。脑脊液 VDRL 结果阳性对神经梅毒的特异性比较高，但阴性也不能排除，需要进行重复检测。脑脊液白细胞计数如果超过10个/mm3，且脑脊液 VDRL 阳性，或虽然 VDRL 检测阴性，但有神经症状，也可诊断神经梅毒。脑脊液蛋白水平高于50mg/dl，或脑脊液螺旋体 DNA PCR 阳性，对神经梅毒的诊断也有帮助。治疗后每6个月应该检查一次脊液白细胞计数直至白细胞指标恢复正常。如果治疗6个月脑脊液白细胞计数仍然不下降或2年后仍未降至正常水平，则应该考虑重新治疗。梅毒的诊断包括物理检查、临床症状、显微镜检查、血清学检查等多种手段。实验室检查是其中重要的方法。先天性梅毒和神经梅毒的诊断有其特殊性。梅毒的治疗需根据患者的患病时期采取合适的治疗方法。
