三酶偶联全细胞生物合成L-酪氨酸.DOC

1、Comment 陈1: 下同。Comment 陈2: 放大？应保持全文一致。Comment 陈3: 摘要应惜字如金，要说明本文最重要的结论。选中部分建议放到结论部分。1三 酶 偶 联 全 细 胞 生 物 合 成 L-酪 氨 酸陈明亮 1，张利坤 1，杨卫华 1，唐云平 2，肖延铭 1 *（ 1.长 兴 制 药 股 份 有 限 公 司 ， 浙 江 长 兴 313100； 2.浙 江 海 洋 大 学 食 品 与 医 药 学 院 ， 浙 江 舟 山316022）摘要:通过将醛缩酶（Aldolase ，ALD）、D-丝氨酸脱水酶（D-Serine Dehydratase，SDH）和酪氨酸酚裂解酶（Ty

2、rosine Phenol-Lyase，TPL）三酶偶联，催化甘氨酸、甲醛和苯酚合成 L-酪氨酸（L-Tyrosine，L-Tyr） 。并以 L-Tyr的质量浓度为指标对 转化工艺进行了考察。经考察确定了结果表明，三酶偶联最佳反应条件为：pH =8.5，温度 35 ，6 g/L乙酸铵、0.1 g/L磷酸吡哆醛（PLP） PLP，三种酶细胞质量配比(ALDSDH TPL)为 635。当甘氨酸加量为 50 g/L，利用上述工艺进行 10000 L放大转化验证，反应 11 h，L-Tyr 质量浓度可达 117 g/L，转化率苯酚转化率为 97%，转化体系放大后转化率苯酚转化率提高 4 %，收率为 8

3、5%。三酶偶联生物法合成 L-Tyr直接将底物甘氨酸、甲醛和苯酚经酶催化反应获得 L-Tyr，节省了 D-丝氨酸和丙酮酸铵的提取步骤，对资源的合理利用以及对绿色合成工艺的开发具有重要的参考意义。关键词：酶偶联；醛缩酶；D-丝氨酸脱水酶；酪氨酸酚裂解酶； L-酪氨酸Biosynthesis of L-Tyrosine with Aldolase, D-Serine Dehydratase and Tyrosine Phenol-LyaseCHEN Ming-liang1，ZHANG Li-kun 1，YANG Wei-hua 1，TANG Yun-ping 2，XIAO Yan-ming1*（

4、1.Changxing PharmaceuticalCO.,LTD,Changxing 313100,Zhejiang,China;2.College of Food Science and Pharmaceutics,Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,Zhejiang,China）Abstract: We used multienzyme coupled catalysis to produce L-Tyrosine(L-Tyr). In this study, Glycine was catalyzed to synthesize D-Se

5、rine by Aldolase(ALD), and D-Serine was transferred to pyruvic acid ammonium by D-Serine Dehydratase(SDH). Then, L-Tyr was synthesized by Tyrosine Phenol-Lyase(TPL) when the substrate phenol was added into the reaction system.The optimal reaction conditions were shown as follows: pH=8.5, 35 , 6 g/L

6、of ammonium acetate, 0.1 g/L of PLP, m(ALD):m(SDH):m(TPL)=6:3:5. We used the above conditions to catalyze glycine at the concentration of 50 g/L for 11 h, the concentration of L-Tyr was 117 g/L with a conversion of 97%, increasing by 4% compared with small-scale test and the yield reached 85%.The me

7、thod of biosynthesis of L-Tyr can not only eliminate the purification process of D-Serine and pyruvic acid 收稿日期：2018-0-0;定用日期：2018-0-0；DOI;10.13550/j.jxhg.20180151作者简介：陈明亮（1990-），男，助理工程师，E-mail:。通讯作者：肖延铭（1986-），男，硕士，研发中心主任，E-mail:。Comment 陈4: 背景信息应精简。科技论文不是科普文章，应有选择性地综述本领域的现状与本文创新点。Comment 陈5: 请改为 c

8、hemdraw双击可以打开编辑的格式。Comment 陈6: 请添加实用性意义，解决什么问题，或者有什么意义？一句话即可。2ammonium, but also has a reference significance for the reasonable utilization of resources and green synthesis process.Key words: three enzyme coupling; aldolase; D-serine dehydratase; tyrosine Phenol-Lyase; L-TyrosineL-L-酪氨酸（L-Tyrosine，

9、简称 L-Tyr）是一种芳香族天然氨基酸，是动物体内合成蛋白质所需要的重要氨基酸之一，其所带的氨基和羧基具有重要的生理功能 1。在医药领域，L-Tyr 是合成甲状腺素、左旋多巴、肾上腺素的前体 2；、在食品领域 和，L-Tyr 是一种重要的添加剂；临床应用上，L-Tyr 还用于生殖避孕疗效研究 3都有非常重要的作用。目前，L-Tyr 的制备方法主要有提取法 4-6、化学合成法、直接发酵法 7-8和生物酶催化法。提取法由于蛋白原料水解液中含有多种氨基酸，其中 L-胱氨酸和 L-Tyr的等电点和溶解度极其相近，从 L-Tyr和 L-胱氨酸的混合物中分离出高纯度的 L-Tyr非常困难，并且天然蛋白资

10、源中 L-Tyr较少，导致效率较低。化学合成法不仅步骤较多，手性差且得到的产物通常为外消旋体，需经拆分才能获得具有生理活性的 L-Tyr9。直接发酵法生产 L-Tyr工艺控制过程复杂， 既要适合微生物自身生长繁殖，又要利于微生物代谢积累，因此，产酸率较低 10。酪氨酸酚裂解酶，也称 -酪氨酸酶，在生物体内催化裂解 L-酪氨酸 L-Tyr生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物体外可以将苯酚、丙酮酸和氨转化为 L-酪氨酸 L-Tyr11。生物酶催化法具有专一性强、反应条件温和、周期短、易分离纯化等优点而日益受到重视，是目前生产 L-Tyr的最为经济有效的方法 1112。酪氨酸酚裂解酶，也称 -酪氨酸酶，可

11、以将苯酚、丙酮酸和氨转化为 L-Tyr12。Para 等通过包埋法积累 L-Tyr达到 10 g/L。Lee 等用 L-丝氨酸路线积累 L-Tyr达到 26.3 g/L，但该工艺存在甘氨酸对 TPL 抑制较强和操作复杂的明显不足。丙酮酸是 TPL合成 L-Tyr的关键底物之一，但其作为一种日化中间体，国内外市场需求增长极其迅速，价格居高不下。化学法生产丙酮酸污染大，成本高；发酵法生产丙酮酸转化率低，操作繁琐易染菌，生产周期长 13。因此，寻求能够廉价生产丙酮酸的方法，意义重大。本文首先通过一锅酶法将底物甘氨酸、甲醛和苯酚经来源于 Achromobacter spanius的醛缩酶(Aldola

12、se，ALD，EC4.1.2.13)、Bacillus subtilis的 D-丝氨酸脱水酶(D-Serine Dehydratase，SDH，EC4.3.1.18)和 Citrobacter freundii的酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine Phenol-Lyase， TPL，EC4.1.99.2)三酶催化反应得到产物 L-Tyr，然后优化了转化工艺条件；最后，利用该工艺进行中试放大验证，并考察了 L-Tyr的收率，反应式 如下所示。发酵法生产丙酮酸具有转化率低，丙酮酸（盐）的积累量低，操作繁琐易染菌，生产周期长等劣势 13。该三酶偶联体系中，通过 ALD和 SDH的联用生成丙酮酸，且该体

13、系避免了 D-丝氨酸和丙酮酸的提取步骤，节省反应时间，提高效率，大大降低了 L-酪氨酸 L-Tyr的生产成本。有望解决丙酮酸成本高的问题。NH2 OHO OH OHONH2 OHOO NH3OHOHNH2OOHALDFormaldehydePLPPLPGlycine D-Serine+PyruvicacidSDHPhenolL-TyrosineTPLComment 陈7: 请提供规格信息，下同。Comment 陈8: 按最新规定，分母中不能包含 mL、mg 等，所以请换算为mg/L。下同。Comment 陈9: 体积分数，请用文字表述，下同。Comment 陈10: 希文用斜体。Comment

14、 陈11: 下同。31实 验 部 分1.1材 料1.1.1菌 种 与 试 剂基因工程重组菌 E.coli BL21(DE3)/pET26b-ALD、E.coli BL21(DE3)/pET26b-SDH和 E.coli BL21(DE3)/pET26b-TPL，长兴制药股份有限公司研发中心分子平台构建并保存。甘氨酸、苯酚购自，AR ，国药集团化学试剂有限公司；磷酸吡哆醛购自，AR，西格玛公司；卡那霉素(Kana)购自，AR ，上海生工生物工程股份有限公司；其他常规试剂均为市售分析纯。1.1.2培 养 基LB/Kana斜面培养基：蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 5 g/L

15、，琼脂粉 20 g/L。调节 pH=至 7.2，121 灭菌 20 min。待培养基冷却至 4050 ，添加事先配制成一定浓度过滤除菌后的卡那霉素(Kana)，使其终浓度质量浓度为 50 mg/Lg/mL，制作斜面。TB/Kana培养基：蛋白胨 12 g，酵母提取物 24 g，甘油 4 mL，溶解于 0.9 L水中，121 灭菌 20 min。待其冷却到 60 ，再加入 100 mL灭菌后含有 0.17 mol/L KH2PO4和 0.72 mol/L K2HPO4的溶液，并添加事先配制成一定浓度过滤除菌后的卡那霉素(Kana)，使其终浓度质量浓度为 50 g/mLmg/L。1.2方 法1.2

16、.1菌 体 细 胞 制 备将上述三 3个菌种分别接于 LB斜面 37 培养 8 h，然后用接种环从 LB斜面上刮取菌体接入装有 50 mL TB/Kana培养基的 250 mL三角瓶中培养 8 h，再将活化好的种子液接入装有100 mL TB/Kana培养基的 500 mL三角瓶中，接种量为体积分数的 0.8%1.2%(v/v)。37 摇床培养至菌体 OD600为 4.06.0，加入终浓度 0.3 mmoL/L的异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，28 诱导 12 h。发酵结束后于 5000 r/min离心 15 min，收集菌体细胞，分别得到三种细菌的菌泥。1.2.2三 酶 偶 联 反 应

17、500 mL反应体系：向 1L三口烧瓶中加入 水 350 mL水、甘氨酸 25 g（0.3 mol）甘氨酸、PLP 0.05 g（0.2 mmol）磷酸吡多醛(PLP)、甲醛 5 mL4 g（0.13 mol）甲醛、无水 Na2SO3 1.2 g（9.5 mmol）无水 Na2SO3、EDTA 1.2 g（4.1 mmol ） EDTA、乙酸铵 3 g（0.039 mol ）乙酸铵、用 NaOH稀溶液将 pH控制在 8.48.6，再加入 30 g产醛缩酶（ALD）菌体细胞、15 g产 D-丝氨酸脱水酶（SDH）菌体细胞 、25 g产酪氨酸酚裂解酶（TPL）菌体细胞，温度控制在 3337 。以

18、50 mg/min的速度流加苯酚，开始反应，反应过程中用甲醛将控制 pH控制在 8.48.6。流加完 31.5 g苯酚后再继续搅拌反应 30 min，停止反应。利用 HPLC检测转化液中苯酚的残留以及 L-酪氨酸 L-Tyr生成量。1.2.3 ALD酶 活 测 定取 0.1 g产 ALD细胞菌体，加入 10 mL反应体系:甘氨酸质量分数 1%，甲醛质量分数1%，4 mmol/L 磷酸吡多醛（PLP），稀盐酸调 pH pH=8.5，35 ，200 r/min条件下进行酶促反应，10 min取样，用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC检测反应液中 D-丝氨酸的浓度。酶活Comment 陈12: 表示

19、变量的字母用斜体。下同。Comment 陈13: 按此格式，下同。4定义为上述条件下每分钟内催化生成 1 mol D-丝氨酸所需要的酶量为一个酶活单位(U)。D-丝氨酸色谱条件：Daicel CROWNPAKCR(+)色谱柱(150 mm4 mm)；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ；检测波长：200 nm；流动相：pH= 1.0 的高氯酸水溶液 14。1.2.4 SDH酶 活 测 定取 0.1 g产 SDH细胞菌体，加入 10 mL反应体系：D-丝氨酸质量分数 1%，稀盐酸调 pH=为 8.5，35 ，200 r/min条件下进行酶促反应，10 min取样，用浓盐酸终止酶促反应，利用H

20、PLC检测反应液中丙酮酸的浓度。酶活定义为上述条件下每分钟内催化生成 1 mol丙酮酸所需要的酶量为一个酶活单位(U)。丙酮酸色谱条件：色谱柱：WondaSil C18柱(250 mm4.6 mm，5 m)；流动相：V5.5 mmol/L二环己胺和 0.02 mol/L的甲酸水溶液：V(乙腈)=95 5；检测波长：230 nm；流速：0.6 mL/min；进样量：20 L；柱温：室温 15。1.2.5 TPL酶 活 测 定取 0.1 g产 TPL细胞菌体，加入 10 mL反应体系：丙酮酸质量分数 1%，苯酚质量分数1%，4 mmol/L 磷酸吡多醛（ PLP），氨水调 pH=为 8.5，温度为

21、 35 ，200 r/min条件下进行酶促反应，10 min取样，用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC检测反应液中 L-Tyr的浓度。酶活定义为上述条件下每分钟内催化生成 1 mol L-Tyr所需要的酶量为一个酶活单位 (U)。苯酚以及 L-Tyr色谱条件：色谱柱：WondaSil C18柱(250 mm4.6 mm，5 m)；流动相：V8.5 mmol/L醋酸钠溶液(磷酸调节至 pH= 4.0)：V(甲醇)=41；检测波长：230 nm；流速：0.6 mL/min；进样量：20 L；柱温：室温 16。转化率以苯酚计，计算公式为： 94.1/%08CXP式中注：X 底物转化率，%；C转化结束

22、时转化液中 L-Tyr的质量浓度（，g/L ）；P转化结束时加入苯酚的总质量浓度，（g/L；）94.11苯酚的分子量；181.19L-Tyr的分子量1.3 单 因 素 考 察1.3.1 pH对 酶 活 的 影 响pH对 ALD 酶活的影响：向 10 mL含有 0.1 g甘氨酸、0.1 g甲醛和 9.88 mg磷酸吡多醛（PLP）的水溶液中加入产 ALD细胞菌体 0.1 g，温度 35 ，200 r/min搅拌速度，不同 pH条件下进行酶促反应，10 min取样，用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC检测反应液中 D-丝氨酸的浓度。pH对 SDH酶活的影响：向 10 mL含有 0.1 g D-丝氨

23、酸的水溶液中加入产 SDH细胞菌体0.1 g，温度 35 ，200 r/min搅拌速度，不同 pH条件下进行酶促反应，10 min取样，用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC检测反应液中丙酮酸的浓度。pH对 TPL酶活的影响：向 10 mL含有 0.1 g丙酮酸、0.1 g苯酚和 9.88 mg PLP的水溶液中加入产 TPL细胞菌体 0.1 g，温度 35 ，200 r/min搅拌速度，不同 pH条件下进行酶促反应，10 min取样，用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC检测反应液中 L-Tyr的浓度。1.3.2 温 度 对 酶 活 的 影 响温度对 ALD酶活的影响：向 10 mL含有 0.1

24、 g甘氨酸、0.1 g甲醛和 9.88 mg PLP的水溶液Comment 陈14: 建议在实验部分增加一节“单因素考察”，将下文中单因素考察的条件都整理到 1.1小节。这样，讨论的时候可以直接说，改变，其他条件参考就可以，即明确又避免歧义。Comment 陈15: 详细操作流程建议放到实验部分。下同。5中加入产 ALD细胞菌体 0.1 g，pH=8.5 ，200 r/min搅拌速度，不同温度条件下进行酶促反应，10 min取样，用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC检测反应液中 D-丝氨酸的浓度。温度对 SDH酶活的影响：向 10 mL含有 0.1 g D-丝氨酸的水溶液中加入产 SDH细胞菌

25、体0.1 g，pH=8.5，200 r/min搅拌速度，不同温度条件下进行酶促反应，10 min取样，用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC检测反应液中丙酮酸的浓度。温度对 TPL酶活的影响：向 10 mL含有 0.1 g丙酮酸、0.1 g苯酚和 9.88 mg PLP的水溶液中加入产 TPL细胞菌体 0.1 g，pH=8.5，200 r/min搅拌速度，不同温度条件下进行酶促反应，10 min取样，用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC检测反应液中 L-Tyr的浓度。1.3.3 投 酶 量 的 确 定ALD投酶量：在 pH=8.5、温度 35 下，向 100 mL含有 0.05 mol甘氨酸、0

26、.13 mol甲醛和 0.4 mmol PLP的水溶液中加入不同浓度的产 ALD细胞菌体，转化生成 D-丝氨酸，测定 1 h产生的 D-丝氨酸量。SDH投酶量：向 100 mL含有 0.05 mol D-丝氨酸的水溶液中加入不同浓度的产 SDH细胞菌体，转化生成丙酮酸，测定 1 h产生的丙酮酸量。TPL投酶量：向 100 mL含有 0.05 mol丙酮酸、0.05 mol苯酚和 0.4 mmol PLP的水溶液中加入不同浓度的产 TPL细胞菌体，转化生成 L-Tyr，测定 1 h产生的 L-Tyr量。1.3.4 乙 酸 铵 对 L-Tyr 产 量 的 影 响在 pH=8.5、温度 35 条件下

27、，向 100 mL含有 2.1 g甘氨酸、2.1 g甲醛、2.6 g苯酚、98.8 mg PLP、6 g ALD、3 g SDH和 5 g TPL的水溶液中加入不同浓度的乙酸铵行进催化反应，考察不同乙酸铵浓度对 L-Tyr产量的影响。1.3.5 PLP浓 度 对 L-Tyr 产 量 的 影 响在 pH=8.5、温度 35 条件下，向 100 mL含有 2.1 g甘氨酸、2.1 g甲醛、2.6 g苯酚、0.6 g乙酸铵、6 g ALD、3 g SDH和 5 g TPL的水溶液中加入不同浓度的 PLP行进催化反应，考察不同 PLP浓度对 L-Tyr产量的影响。2 结 果 与 讨 论2.1 pH对

28、三 酶 偶 联 反 应 的 影 响ALD的最适 pH：向 10 mL含有 0.1 g甘氨酸、0.1 g甲醛和 9.88 mg磷酸吡多醛（PLP ）的水溶液中加入产 ALD细胞菌体 0.1 g，温度 35 ，200 r/min搅拌速度，不同 pH条件下进行酶促反应，10 min 取样，用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC检测反应液中 D-丝氨酸的浓度。SDH的最适 pH：向 10 mL含有 0.1 g D-丝氨酸的水溶液中加入产 SDH细胞菌体 0.1 g，温度 35 ，200 r/min搅拌速度，不同 pH条件下进行酶促反应，10 min取样，用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC检测反应液中丙

29、酮酸的浓度。TPL的最适 pH：向 10 mL含有 0.1 g丙酮酸、0.1 g苯酚和 9.88 mg PLP的水溶液中加入产TPL细胞菌体 0.1 g，温度 35 ，200 r/min搅拌速度，不同 pH条件下进行酶促反应，10 min取样，用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC检测反应液中 L-Tyr的浓度。以固定改变反应 pH，其他条件参考 1.3.1，以在不同 pH条件下测得的最高酶活为 100%，分别计算 3种酶的各自相对酶活，结果如图 1所示。Comment 陈16: 请添加至图上面的正文中，并给出具体数值。Comment 陈17: 请改为 origin双击可以打开编辑的格式。下同。

30、6由图 1可知，ALD 的适宜 pH=为 7.5，SDH 的适宜 pH=为 8.0，TPL 适宜 pH=为 8.5，在pH=为 7.5时，SDH 和 TPL的酶活较低，在 pH为=8.0 时 TPL的酶活较低，在 pH=为 8.5时三种酶均具有较高的酶活，综合考虑选择 pH= 8.5作为催化体系反应 pH。因为酶在不同 pH下表现出不同的酶活，在其最适 pH时，活性最强，酶促反应速度最大，低于最适 pH或高于最适pH都会使酶活下降。三酶偶联时需要从整体考虑，选择适当的 pH使得整体的催化效率最高，故选择 pH= 8.5作为反应条件。 6.57.0.58.0.59.0.51.08059105相对

31、酶活/%pH ALDSHTP6.57.0.58.0.59.0.510.8059105/%pH ALDSHTP固定条件：反应温度、投酶量、底物浓度以及反应时间图 1 pH对酶活的影响Fig. 1 Effect of pH on enzyme activity由图 1可知，ALD 的适宜 pH=7.5，SDH 的适宜 pH=8.0，TPL 适宜 pH=8.5，在 pH=7.5时，SDH和 TPL的酶活较低，在 pH=8.0时 TPL的酶活较低，在 pH=8.5时三种酶均具有较高的酶活，综合考虑选择 pH=8.5作为催化体系反应 pH。因为酶在不同 pH下表现出不同的酶活，在其最适 pH时，活性最强

32、，酶促反应速度最大，低于最适 pH或高于最适 pH都会使酶活下降。三酶偶联时需要从整体考虑，选择适当的 pH使得整体的催化效率最高，故选择 pH=8.5作为反应条件。2.2温 度 对 三 酶 偶 联 反 应 的 影 响ALD的最适温度：向 10 mL含有 0.1 g甘氨酸、0.1 g甲醛和 9.88 mg PLP的水溶液中加入产 ALD细胞菌体 0.1 g，pH= 8.5，200 r/min搅拌速度，不同温度条件下进行酶促反应，10 min取样，用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC检测反应液中 D-丝氨酸的浓度。Comment 陈18: 请在图中左上角直接注明 ALD，下同。7SDH的最适温度

33、：向 10 mL含有 0.1 g D-丝氨酸的水溶液中加入产 SDH细胞菌体 0.1 g，pH= 8.5，200 r/min搅拌速度，不同温度条件下进行酶促反应，10 min取样，用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC检测反应液中丙酮酸的浓度。TPL的最适温度：向 10 mL含有 0.1 g丙酮酸、0.1 g苯酚和 9.88 mg PLP的水溶液中加入产 TPL细胞菌体 0.1 g，pH= 8.5，200 r/min搅拌速度，不同温度条件下进行酶促反应， 10 min取样，用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC检测反应液中 L-Tyr的浓度。改变反应温度，其他条件参考 1.3.2，以在不同温度下测

34、得的最高酶活为 100%，分别计算3种酶的各自相对酶活，结果如图 2所示。由图 2可知，综合 3种酶酶活随温度的变化曲线，选择 35 作为催化体系的反应温度。因为酶在不同温度下表现出不同的酶活，在其最适温度范围内，活性最强，酶促反应速度最大，低于最适温度或高于最适温度都会使酶活下降。三酶偶联时需要从整体考虑，选择适当的温度使得整体的催化效率最高，故选择温度 35 作为反应条件。 152053054050675809510相对酶活/%T/ ALDSHTP152053054050675809510相对酶活/%T/ ALDSHTP固定条件：反应 pH、投酶量、底物浓度以及反应时间图 2 温度对酶活的

35、影响Fig. 2 Effect of temperature on enzyme activity由图 2可知，综合 3种酶酶活随温度的变化曲线，选择 35 作为催化体系的反应温度。因为酶在不同温度下表现出不同的酶活，在其最适温度范围内，活性最强，酶促反应速度最大，低于最适温度或高于最适温度都会使酶活下降。三酶偶联时需要从整体考虑，选择适当的温度使得整体的催化效率最高，故选择温度 35 作为反应条件。2.3投 酶 量 的 确 定分别改变三种酶的投酶量，其他条件参考 1.3.3，分别得出三种酶投酶量与反应速度的关系，如图 3a、3b 和 3c所示。在该转化体系中确定 3种酶的配比既能提高转化速度

36、又能达到最佳经Comment 陈19: 请在图中左上角直接注明 ALD，下同。Comment 陈20: 不通顺8济效益。在 pH= 8.5、温度 35 下，向 100 mL含有 0.05 mol甘氨酸、0.13 mol甲醛和 0.4 mmol PLP的水溶液中加入不同浓度的产 ALD细胞菌体，转化生成 D-丝氨酸，测定 1 h产生的D-丝氨酸量，如图 3a所示；向 100 mL含有 0.05 mol D-丝氨酸的水溶液中加入不同浓度的产SDH细胞菌体，转化生成丙酮酸，测定 1 h产生的丙酮酸量，如图 3b所示；向 100 mL含有0.05 mol丙酮酸、0.05 mol苯酚和 0.4 mmol

37、 PLP的水溶液中加入不同浓度的产 TPL细胞菌体，转化生成 L-Tyr，测定 1 h产生的 L-Tyr量，如图 3c所示。因为当 1 h生成 D-丝氨酸生成产物 0.07 mol/L时，SDH 正好将生成的 D-丝氨酸转化为0.07 mol/L的丙酮酸，同时 TPL正好将生成的丙酮酸转化成 0.07 mol/L的 L-Tyr，如此反应 12 h L-Tyr产物浓度 质量浓度可达 120 g/L，总投酶量比较经济，在工业生产上可获得一定利润，且有较好的可行性，符合工业生产要求。此时三种酶的质量浓度分别为 ALD 60 g/L、SDH 30 g/L、 TPL 50 g/L。故选择三种酶的细胞质量

38、配比为 ALD 60 g/L、SDH 30 g/L、TPL 50 g/L。01230456078.03.45.607.89D-丝氨酸浓度/molL(ALD)/gADa10230450670.03.450.67.809产物浓度/（molL-1） 投 酶 量 /（ gL-1）a01230456078.406.810.24丙酮酸浓度/(molL(ALD)/gSDHbComment 陈21: 横坐标统一改为（）/（g/L），表示的质量浓度，单位也应为分数形式。Comment 陈22: 不通顺910230450670.0.46.801.24产物浓度/（molL-） 投 酶 量 /（ gL-1）（ b）0

39、1230456078.0.4.60.8.1L-Tyr浓度/molTPL/gTPL(c)10230450670.0.4.60.8.1产物浓度/（molL-） 投 酶 量 /（ gL-1）（ c）固定条件：反应温度、反应 pH、底物浓度、反应时间、PLP 浓度以及乙酸铵浓度图 3 酶浓度配比对反应速度的影响Fig. 3 Effect of enzyme concentration on reaction rate由图 3可知，当 1 h生成 D-丝氨酸 0.07 mol/L时，SDH 正好将生成的 D-丝氨酸转化为0.07 mol/L的丙酮酸，同时 TPL正好将生成的丙酮酸转化成 0.07 mol

40、/L的 L-Tyr，如此反应 12 h L-Tyr质量浓度可达 120 g/L，总投酶量比较经济，在工业生产上可获得一定利润，且有较好的可行性，符合工业生产要求。此时三种酶的质量浓度分别为 ALD 60 g/L、SDH 30 g/L、TPL 50 g/L。故选择三种酶的细胞质量配比为 ALD 60 g/L、SDH 30 g/L、TPL 50 g/L。2.4 乙 酸 铵 对 L-Tyr 产 量 的 影 响改变乙酸铵的浓度，其他条件参考 1.3.4，考察不同乙酸铵浓度对 L-Tyr产量的影响，在pH= 8.5、温度 35 条件下，向 100 mL含有 2.1 g甘氨酸、2.1 g甲醛、2.6 g苯

41、酚、98.8 mg Comment 陈23: g/L是质量浓度的单位，mo/L 才能简称为浓度。下同。Comment 陈24: g/L是质量浓度的单位，mo/L 才能简称为浓度。下同。10PLP、6 g ALD、3 g SDH和 5 g TPL的水溶液中加入不同浓度的乙酸铵行进催化反应，考察不同乙酸铵浓度对 L-Tyr产量的影响，结果如见图 4所示。随着乙酸铵浓度的增加 L-Tyr的产量也在增加，当乙酸铵浓度质量浓度到达 6 g/L后 L-Tyr的产量维持不变。因为乙酸铵有助于该反应朝正反应方向进行，不同乙酸铵浓度下 L-Tyr的产量不同，当乙酸铵浓度质量浓度达到 6 g/L时该促进作用达到上

42、限，再增加乙酸铵浓度 L-Tyr产量不会进一步提高，故选择乙酸铵浓度质量浓度 6 g/L。 1234567853054050L-Tyr/g/gL1234567853054050L-Tyr浓度/（g-1） 乙 酸 铵 浓 度 /（ gL-1）固定条件：反应温度、反应 pH、底物浓度、反应时间、PLP 浓度以及酶配比图 4 乙酸铵浓度对 L-Tyr产量的影响Fig. 4 Effect of ammonium acetate concentration on L-Tyr yield由图 4可知，随着乙酸铵浓度的增加 L-Tyr的产量也在增加，当乙酸铵质量浓度到达 6 g/L后 L-Tyr的产量维持不

43、变。因为乙酸铵有助于该反应朝正反应方向进行，不同乙酸铵浓度下 L-Tyr的产量不同 ，当乙酸铵质量浓度达到 6 g/L时该促进作用达到上限，再增加乙酸铵浓度L-Tyr产量不会进一步提高，故选择乙酸铵质量浓度 6 g/L。2.5 PLP浓 度 对 L-Tyr 产 量 的 影 响改变 PLP的浓度，其他条件参考 1.3.5，考察不同 PLP浓度对 L-Tyr产量的影响，在 pH= 8.5、温度 35 条件下，向 100 mL含有 2.1 g甘氨酸、2.1 g甲醛、2.6 g苯酚、0.6 g乙酸铵、6 g ALD、 3 g SDH和 5 g TPL的水溶液中加入不同浓度的 PLP行进催化反应，考察不同 PLP浓度对 L-Tyr产量的影响，结果如见图 5所示。随着 PLP浓度的增加 L-Tyr的产量也在增加，当PLP浓度到达 0.1 g/L后 L-Tyr的产量达到最高，再增加 PLP的浓度 L-Tyr产量不变。因为 PLP作为 ALD和 TPL的辅酶，在反应中起传递电子的作用，增加 PLP浓度可加快反应进程，当PLP浓度 质量浓度 达到 0.1 g/L时该促进作用达到上限，再增加 PLP浓度 L-Tyr产量不会进