1、 细胞工程： 以生物细胞、组织或器官为研究对象，运用工程学原理，按照预定目标，改变生物性状 ,生产生物产品，为人类生产或生活服务的科学。 培养基母液： 把培养基中的各种大量元素用量扩大 l0 倍，微量元素、有机元素和激素等用量扩大 l00 倍，分别或混合溶解制成浓缩液，这种浓缩液称为母液 植物生长调节物质： 调节植物生长的物质，以极微小的量影响到植物细胞的分裂、分化、发育，影响植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠、萌发等许许多多的生理生化活动，包括植物激素和人工合成的植物生长调节剂 离体 培养： 指从植物体分离出符合需要的组织、器官、细胞或原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件
2、下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术 细胞全能性： 是指细胞具有发育成完整个体的遗传潜能。也可以指个体某个器官或组织已经分化的细胞在适宜的条件下再生成完整个体的遗传潜能。 外植体： 指用于离体培养的活的植物器官、组织、细胞和原生质体等 愈伤组织： 自然条件下，植物在受伤之后，创伤部位的细胞脱分化不断增殖，形成松散排列、无特定结构的非器官化组织 组织培养中，人工培养基上由外植体细胞 经脱分化产生的一团不定形的、疏松排列的、没有分化的薄壁细胞 极性： 通常是指在器官、组织甚至细胞中，在不同的轴向上存在某种形态结构和生理生化上的梯度差异。 细胞分化： 由发育起始状态的合子
3、沿个体发育方向不断分化出形态结构、生理功能不同的细胞、组织、器官而最终形成完整植株的过程 细胞去分化： 一个成熟细胞回复到 分生状态或胚性细胞状态 的现象，即失去已分化细胞的典型特征的过程 细胞再分化： 脱分化的分生细胞重新恢复分化能力，沿着正常的发育途径，形成具有特定结构和功能的细胞的过程 胚状体： 经 体细胞胚发生形成类似合子胚的结构 次生胚： 有些植物从体细胞胚的细胞中又可产生体细胞胚，这一过程称为重复体细胞胚胎发生，形成的体细胞胚称为次生胚 胚性细胞： 又称体胚原始细胞， 一类独特的细胞，它与分生细胞相似，通常较小，近圆形，具较大的核和核仁，并能高度染色，胞质浓厚 看护培养： 用一块活
4、跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞使其生长和增殖 人工种子： 将植物离体培养中产生的胚状体（体胚）或者能发育成完整植株的分生组织（不定芽、小鳞茎、短枝、毛状根、愈伤组织等），包裹在有养分和具有保护功能的物质中 形成的类似于天然植物种子的结构，并在适宜条件下发芽出苗的颗粒体。 原生质体： 去除细胞壁后存活的植物细胞 细胞系： 经过再培养后而形成的具有增殖能力、特性专一、类型均匀的培养细胞 细胞融合： 是在自发或人工诱导下，两个不同 基因型 的细胞或 原生质体融合 形成一个杂种细胞 。 体细胞杂交 :采用细胞融合的方法，使原来不能或很难进行有性杂交的两种生物，通过体细胞融合将它们的染色体核基因共存于
5、一个杂交细胞 体细胞变异： 非性细胞产生的遗传变异或表观遗传变异 体细胞无性系变 异：植物外植体经组织、细胞培养的脱分化和再分化过程，表现于再生植株中的变异 突变体： 是指发生突变的个体，具有与野生型不同的表型的特点。 由于基因或染色体的 DNA 序列发生改变，导致细胞或生物体获得了不同于野生型（原始、未突变）的新表型 异核体： 不同种属或同一种属的不同生物个体的亲本细胞发生融合所形成的含有不同细胞核的融合细胞 成批培养： 将一定量的细胞或细胞团分散在一定量的液体培养基中进行密封培养看卖弄 原代培养： 也称初代培养期。从体内取出组织接种在培养瓶中培养到第一次传代前阶段，一般持 续 1-4 周。
6、 继代培养：是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养 接触抑制： 当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加 【简答题】： 1.简述细胞工程在生物技术领域中的地位。 细胞工程是细胞水平上的生物工程，是现代生物技术的桥梁与纽带，也是该领域中最直接应用于生产实践并取得显著效益的应用科学。它与其他相关学科理论（基因工程、发酵 工程、生化工程等）交叉发展，必须与其它生物技术相结合才能更好地发挥作用 2.目前，常用的植物细胞培养
7、基种类有哪些？各有什么特点？ 1） MS 培养基 特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的平衡溶液。养分的数量和比例较合适 2） B5 培养基 其主要特点是含有较低的铵，这是因为铵对不少培养物的生长有抑制作用。 3） White 培养基 其特点是无机盐数量较低，适于生根培养 4） N6 培养基 其特点是成分较简单， KNO3 和（ NH4） 2SO4 含量高。 5） KM8P 培养基 其特点是有机成分较复杂，它包括了 所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合培养。 3.配制培养基时，为什么要先配母液？如何配制母液？ 1）培养基中含有的元素很多，每次配制培养基时，要对所有的元素一个个进行称量、溶解，
8、非常繁琐。特别是微量元素用量很少，用普通天平很难称量准确。配制母液不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏，可多次利用 2）确定培养基 -按照扩大倍数称量 -溶解 -按顺序混合 -定容 -母液分装 -贴标签 -保存于冰箱 大量元素应配成浓度为 10 倍的母液，一般将微量元素配制成 100 倍的母液，使用时再稀释 100 倍 配置时化合物应分别称量，分别溶解；混合时注意先后顺序，防止产生沉淀；混合时要边搅拌边混合 4.例举三种常用的物理灭菌方式，简述其原理和优缺点。 湿热灭菌：在密闭的蒸锅内，蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在
9、0.1MPa 的压力下，锅内温度达到 121。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢（穿透力强） 干热灭菌：利用烘箱烘烤灭菌，温度与灭菌时间成反比，一般设定 160，灭菌时间 2-3h，主要用于玻璃器皿的灭菌 过滤灭菌：用 细菌不能通过致密具孔滤材的原理以除去气体或液体中微生物的方法。常用于气体、热不稳定的药品溶液或原料的除菌 5.常用的灭菌方法有哪些，各有哪些优缺点？ 1）湿热灭菌（高压蒸汽灭菌） 优点：高温高压蒸汽对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡，是一种最有效的灭菌方法。 缺点：如果是对培养基或液体溶液灭菌，灭菌时间与需要灭菌的培养基或液体溶液的
10、体积密切相关，时间不足达不到灭菌效果，时间过长培养基内的化学物质遭到破坏，影响培养基成分。 2）过滤除菌 优点：有些灭菌的材料不能受热，可以用过 滤法来灭菌，可以滤除绝大多数微生物的营养细胞 缺点：易污染， 过滤法的最大缺点是不能滤除病毒 .多数滤器具吸附性 3）干热灭菌 优点：在干热条件下可将细菌杀死，方便，不易污染，杀菌效果较理想 缺点：干热灭菌存在能源消耗大、浪费时间、安全性差问题；在干燥状态下，热穿透力弱，温度不宜均匀 4）紫外线灭菌 优点：具有较高的杀菌效率，运行安全可靠；对隐孢子虫和贾第虫有特效消毒效果；不产生有毒有害产物；操作简单 缺点：由于紫外线穿透物质的能力很弱，所以只适于空
11、气中和物体表面的灭菌，而且要求距照射物质以不 超过 1.2m 为宜。 5）药剂灭菌 优点：方法简便，只需要药剂喷洒在要消毒的空间或材料表面即可，杀菌又除尘 缺点：浓度太高，可能有腐蚀作用 6.配制培养基时，加入一定量的植物生长调节物质，它们在离体培养过程中有哪些作用？ 包括植物生长调节剂与植物激素，是植物细胞生长的调节物质，以极微小的量起作用。它能诱导细胞分裂、愈伤组织再分化以及胚状体发育。植物激素主要包括生长素类、细胞分裂素类和赤霉素类，有时也使用脱落酸、乙烯等物质。 生长素类：用于诱导愈伤组织的形成、根的分化以及细胞的分裂和伸长，诱导胚状体产生 细胞分裂素类：促进细胞分裂和分化，诱导胚状体
12、和不定芽形成，延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成 赤霉素：加速细胞的伸长生长，也促进细胞分裂。 大多数情况下对组培中器官和胚状体的形成表现抑制作用，但对已形成器官和胚状体的生长通常有促进作用 脱落酸：适量的 ABA 可提高体细胞胚发生的频率和质量，抑制异常体细胞胚的发生 7.试述植物细胞全能性的含义和应用。 含义：植物细胞无论是体细胞还是生殖细胞均具有该物种的全套遗传信息；只有在适宜的条件下，植物细胞才具有发育成完整植株的能力；植物每个细胞均具有发育成完整植株的能力 应用：无性系的快速繁殖；培养无病毒种苗；新品种的选育（花培和单倍体育种、离体胚培养和杂种植株的获得、体细胞诱变和突变体筛选、细胞融
13、合和杂种植株的获得）；人工种子；药用植物和次生物质的工业化生产 8.实现植物细胞全能性的条件是什么？ 具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影响下解脱出来，使其处于独立发育的离体条件下；赋予离体细胞一定刺激，包括营养物质、植物激素、光周期、温度、酸碱度等 9.优良愈伤组织有何生长特性？ （ 1）高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植物 （ 2）容易散碎，以便用这些愈伤组织 建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体 （ 3）旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系 （ 4）经过长期继代保存而不丧失胚性，便有可能对它们进行各种遗传操作 10.何
14、为胚状体？胚状体和合子胚有何异同？ 胚状体 离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，此现象无论在体细胞培养还是生殖细胞培养中均可以看到，因而统称为体细胞胚或胚状体。 异：胚状体起源于非合子细胞，是体细胞体外培养而来，不同于合子胚，合子胚是经过受精发育而来的 与合子胚相比， 体细胞胚子叶不规范、胚小、含水量高、对脱水敏感、没有休眠 相同点：都含有一整套遗传信息 ,都可以发育成新一代生物个体。胚状体的维管束与合子胚一样 ,是独立产生的 ,与母体维管束不相连 11.影响胚状体发生的主要因素有哪些？ 因素：氮源【 NH4+与 NO3-的相对和绝对量都影响体细胞胚的发
15、生，诱导培养基中还原态氮的存在与否最为关键】 生长素【内源 IAA 含量上升或维持在相对高水平是诱导胚性细胞发生的基础，胚性愈伤组织内源生长素的含量远高于非胚性愈伤组织】 组织起源【对于距活体胚胎发育较近的组织和成熟及未成熟的胚胎在离体条件 下可能更利于体细胞胚的诱导】 供体植物的基因型、培养物的生理状况、培养基中的外源激素、天然提取物和活性炭等都可影响胚状体的发生 12.如何区分离体培养条件下的不定芽和胚状体？ 体细胞胚经过了胚胎发育过程，具有胚根、胚芽和胚轴的完整结构 体细胞胚最根本的特征为两极性，即在发育的早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端；不定芽是在器官发生方式分化的单极性特征下
16、形成的。体细胞胚的维管组织分布是独立的“ Y”字形结构，与外植体组织无结构上的联系；而愈伤组织上分化的不定芽一般在愈伤组织表面，与外植体或愈伤组织的维管组织相联系 13.目前研制的人工种子结构是怎样的？ 人工种子由以下三部分组成： 具有良好发育的体细胞胚，并能发育成正常完整植株：广义的体细胞胚由组织培养中获得的体细胞胚即胚状体、愈伤组织、原球茎、不定芽、顶芽、腋芽或小鳞茎等繁殖体组成。 人工胚乳，一般由含有供应胚状体养分的胶囊组成，养分包括矿质元素、维生素、碳源及激素等。 胶囊之外的包膜称之为人工种皮，有防止机械损伤及水分干燥等保护作用。 14.控制胚性细胞同步化的方法有哪些？ 抑 制剂法促进
17、细胞同步分裂；培养初期加入 DNA 合成抑制剂，使 DNA 合成暂时停止，当除去 DNA 合成抑制剂，细胞开始进行同步分裂 低温处理促进细胞同步分裂；抑制了细胞分裂，一段时间后再恢复正常培养温度 渗透压控制同步化法；不同发育阶段的胚，具有不同的渗透压要求，通过调节渗透压来控制胚的发育，使其停留在某一阶段，然后同步发育 同步胚的分段收集筛选法；用不同孔径的尼龙网或采用密度梯度离心来选择不同发育阶段的胚，然后再转入适宜它们发育的培养基上，使幼胚继续发育。 通气法。乙烯的产生与细胞分裂密切相关，在细胞分裂达 到高峰前，有一个乙烯合成高峰，在培养基中通入乙烯或氮气，控制细胞同步分裂 15.植物离体无性
18、繁殖主要适用于哪些植物？与常规无性繁殖相比有什么优势？ 植物离体无性繁殖主要适用于园艺观赏植物、农作物、药用植物及经济林木的种苗生产。 （ 1）周期短，便于控制培养条件。繁殖速度快，经济效益高。（ 2）占用空间小，不受地区、季节限制。（ 3）繁殖珍稀、濒临苗木和突变体，是优良品种培养的有效途径。（ 4）利物保持原来品种的特性。 16.分离植物单细胞的方法有哪些？ 有以下三种： (一 )机械法 :主要通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离 的单细胞。 (二 )酶解法：主要是根据植物细胞壁的组成特点选用某一专一性水解酶，在温和条件下将壁物质分解掉，从而释放出细胞。 (三 )愈伤组织诱导法：通过组织培
19、养获得 callus，由于细胞结构松散，可通过高频振动使单个细胞分离处理 17.植物单细胞培养的方法有哪些？各有何特点？ 1、平板培养法 特点：单细胞在培养基中分布均匀，便于定点观察，易筛选；通气差，排泄物易积累造成细胞毒害 2、 看护培养 特点：简便、成功率高；不能在显微镜下直接观察 . 3、 饲养层培养 特点：操作简便；不能在显微镜下追踪细胞的分裂和细胞团的形成 4、 微室培养法 特点： 在培养过程中可连续进行显微镜观察；由于培养基少，水分难以保持，培养基的成分及 pH 等也易于变动，细胞短期培养后往往不能再生长。 5、 液体浅层静置培养法 特点 : 易于补加新鲜培养基、可以镜检 6 悬浮
20、培养法 特点：能提供大量同步分裂的细胞，且细胞增殖速度快，可用于大规模工业化生产 7 双层滤纸植板法：在饲养细胞层与靶细胞层之间放两层滤纸，上面一层滤纸用于把靶细胞转移到其它培养基上继续培养。 8 条件培养 :含有植物细胞培养上清液或静止细胞；在平板培养和看护培养的基础上发展起来的；看护培养中愈伤组织可以提供单细胞生长繁殖所 需的物质；植物细胞上清液或静止细胞也有相同效果 18.什么叫细胞的悬浮培养？分批培养和连续培养各有何特点？ 细胞的悬浮培养：将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法。 分批培养特点：培养系统基本处于封闭状态，要及时更换培养液进行继代培养；细
21、胞数量随着培养时间的变化呈 S 形曲线；操作简单，重复性好，往往能获得理想的培养效果；特别适合于突变体的筛选、遗传转化等研究 连续培养特点：培养过程中培养液不断得到更换；设备复杂，但便与自动化，产品质量稳定；营养物利用率低于分批培养，菌种易退化，易污 染，因此连续时间有限 19.在细胞悬浮培养中，如何进行细胞生长量的计算？ （ 1）细胞计数：通常用血球计数器计数，计算较大的细胞数量时，可以使用特制的计数盘； （ 2）细胞密实体积（ PCV）：以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示， 测定时，将细胞 离心于离心管内，测定细胞层所占的体积。 （ 3）细胞鲜重：将悬浮培养物倒在下面架有漏斗的已知重量
22、的湿尼龙网上，用水洗去培养基，真空抽滤以除去细胞上沾着的多余水分，称重 （ 4）细胞干重：用以知质量的干尼龙网依上法收集细胞，在 60 C 下烘箱内烘 12h，细胞干重恒定后再称重 （ 5）有丝分裂指数： 指在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数。 通过富尔根染色法对愈伤组织染色，再在载玻片上制片并镜检，随机检查 500 个细胞，统计处于有丝分裂各个时期的细胞数。 指数越高，表明细胞分裂速度越快 20.悬浮培养细胞同步化的方法主要有哪些？ 1、物理方法 (1)分选法 : 细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞利用一定大小的筛网过滤分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体
23、系中 (2)冷处理法 : 收集细胞 ,在 4温度下处理数天 ,添加新鲜培养液培养 . 2、化学方法 (1) 饥饿法：先对细胞 断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1 期或 G2 期，经过一段时间的饥饿之后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。 (2)抑制法：通过向培养基中添加尿苷 (1 g/ml),5-氟脱氧尿苷 (2 g/ml)等化学抑制剂抑制细胞分裂 ,可使培养细胞同步化。 (3)有丝分裂抑制法 :在指数生长期的细胞悬浮培养物中加入一定浓度的秋水仙素 21.在植物细胞培养中如何提高植物次生代谢产物的产量？ （一）筛选得到高产细胞系 （株）
24、常用方法有： 1、克隆选择（有相同遗传基因的细胞群） 指通过单细胞克隆技术和细胞团克隆技术，将培养细胞中能够积累较多次生代谢物且具有相同遗传基因的细胞群挑选出来，并加以适当的培养形成高产细胞系。 2、抗性选择 指在选择压力下，通过直接或间接的方法得到抗性变异的细胞系。 3、诱导选择 是通过化学诱变或紫外线照射等各种物理化学方法诱变产生比原亲本细胞全成能力高的细胞系（株） （二）培养条件 1 适宜温度 2、不断调节 PH 3、营养成分：一方面要满足植物细胞的生长所需，另一方面要使每个细胞都能合成和积累次生代谢产物。 4、光：包括光强、光质和光照时间对细胞生长和次生代 谢产物合成都有一定影响。 5
25、、通气量和搅拌转速 6、前体饲喂 7、诱导子的应用：诱导子是指能引起植物细胞某些代谢强度或代谢途径的物质，可分为生物诱导子和非生物诱导子。不同诱导子作用于不同植物可以产生多种多样的次生代谢产物。 8 培养方法 :两步培养法、两相培养法（有利于代谢物的分离提取，促进胞内代谢物的分泌）等 22.简述细胞活力鉴定的方法。 1、 相差显微镜观察法：观察细胞质环流和正常细胞核的存在 2、 FDA 染色法 ：在活细胞内 FDA 可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分（荧光素）释放出来。荧光素不能自由地穿越细胞质膜，能 在完整的活细胞中积累，紫外线照射下发绿色荧光 3、伊凡蓝染色法：只有活力受损伤的细胞和死细
26、胞能够摄取这种染料 4 氧电极法：活细胞光合作用放出氧气 23.简述细胞计数的方法 24.影响原生质体分离效果的因素有哪些？试做分析。 （ 1） 材料种类和生理状况：植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体的最方便、最合适的植物材料。用于分离原生质体的愈伤组织或悬浮细胞应当处于生长早期或指数生长期 （ 2） 酶解温度：温度高、得率高，但存活率低 （ 3） 酶解时间：过短得率小、过长存活率低 （ 4） 渗透压稳定剂的种类和浓度：因种而异 （ 5） 氧气：酶解时尽量 采用振荡，使细胞得到足够的氧气进行呼吸作用 （ 6） 黑暗：抑制原生质体形成细胞壁 （ 7） 酶液活力：储存时间过长会
27、使酶液失活 25.制备原生质体时为何要在等渗或稍高渗溶液中进行？ 只有培养在等渗或稍高渗培养基中植物才能正常生长 如果植物的原生质体培养在非等渗或低渗或高渗培养液中植物有可能会因为浓度差而吸水或是失水从而导致植物的死亡， 所以植物的原生质体要培养在等渗或稍高渗培养基中。 26.原生质体再生植株的基本过程。 （ 1） 细胞壁再生 （ 2） 细胞分裂：分裂前细胞质增加、色素体扩大、颜色加深 （ 3） 再生植株：直接分裂形成苗（第一次分裂便表现 极性）；通过愈伤组织形成苗；通过球状体再生成苗（原生质体 -细胞 -表面光滑的球状体或盘状体 -通过出芽方式形成小苗） 27.简述原生质体培养的意义。 研究细胞壁的再生过程和植株的再生过程；为植物细胞融合扫平了障碍，特别是为制造新杂种（种间杂种）开辟了道路；原生质体可摄入外源 DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性可与植物全能性相结合，为植物遗传修饰打下基础；获
