1、四环素耐药基因在养猪场猪粪和土壤中的分布研究摘 要：该文采用 PCR 方法研究了养猪场中猪粪和土壤中耐四环素乳糖发酵型肠杆菌（TR-LFE）中的 tet-R 分布和多样性。结果表明，在分离的 258 株耐四环素乳糖发酵型肠杆菌中，共检测到 191 株含有 tet-R基因，占 74.03%。各样品的耐四环素乳糖发酵型肠杆菌中 tet-R 基因的检出率范围为 3.12%96.87%。根据检出频率的大小，各类 tet-R 基因的排列顺序为：tet（A） ，tet（B） ，tet（M） ，tet（G） ，tet（C） ，tet（D） ，tet（S） ，所有样品都没有检测到 tet（O）和 tet（X）
2、 。 关键词：耐四环素乳糖发酵型肠杆菌；四环素耐药基因；猪粪；土壤 中图分类号 S815 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）07-13-03 Abstract：In this paper，PCR was applied to analyze the distribution and diversity of tetracycline resistant genes（tet-R gene）in tetracycline resistant Lactose-fermenting Enterobacteriaceae（TR-LFE） separated from swine m
3、anure and soil in hoggery.The research results showed that 191 of the 258 strains of TR-LFEs were detected to be tet-R gene positive，accounting for 74.03%.The rates of tet-R gene positive TR-LFE were in the range of 3.12%96.87%.Based on the detection frequency of tet-R genes，the general rank of tet-
4、R genes was set out as follows： tet （A） ，tet （B） ，tet （M） and tet （G） and tet （C） and tet （D） and tet （S）.All the samples were not detected to be tet （O） and tet （X）. Key words：Tetracycline resistant Lactose-fermenting Enterobacteriaceaer；Tetracycline resistant genes livestock feces；Pig manure；Soil
5、1 前言 自 Pruden 等1第一次将抗性基因作为一种新兴的环境污染物提出以来，抗性基因在全球范围内引起了广泛的关注。随着人类对抗生素的需求日益增加，抗性基因的污染问题日益加重。抗生素是人类抵御细菌感染类疾病的武器，一旦致病菌获得这些耐药基因，就会形成“超级细菌” ，它几乎可以抵御所有的抗生素。如 2011 年德国暴发了蔓延了欧洲9 个国家的“毒黄瓜”事件，是由一种新型的高传染性有毒菌株-O104：H4 血清型肠杆菌出血性大肠杆菌引起的，该菌株携带氨基糖苷类、大内环酯类、磺胺类等抗生素耐药基因，因抗生素治疗无效，而导致 33人确认死亡，3 000 多人受到感染，至少 470 人出现肾功能衰竭
6、并发症2。目前已发现的四环素类抗性基因的种类达到 40 种以上，此外还有 4种磺胺类抗性基因和 10 种 -内酰胺类抗性基因。抗生素被用来预防和治疗动物疾病以及用作动物促生长剂，四环素作为一种广谱抗生素广泛用于禽畜养殖业3。抗生素进入人或动物体内，会诱导产生抗性菌株4，其中 25%75%的抗生素以原态或络合态的形式排出体外5，这些抗生素随粪便进入到环境中，会对环境中的微生物产生选择压力，诱导其产生大量的抗生素抗性基因6。本文通过普通 PCR 方法研究了养猪场猪粪和土壤中耐四环素乳糖发酵型肠杆菌（TR-LFE）中的 tet-R 分布和多样性。2 材料与方法 2.1 样品采集 本次实验的样品采自上
7、海市松江区某养猪场的新鲜公猪猪粪（GZ） 、母猪猪粪（MZ）和养猪场内的蔬菜种植地的土壤（TR） 。采样时间为分别为 2014 年 9 月、11 月和 2015 年 1 月。 2.2 菌株分离 乳糖发酵型肠杆菌（LFE）采用麦康凯培养基分离培养，耐四环素乳糖发酵型肠杆菌（TR-LFE）参见文献7。 2.3 PCR 实验 实验分离出 258 株耐四环素 LFE。采用水煮法提取全细胞 DNA，方法参见文献7。本实验采用 9 种不同的目标引物进行普通PCR 检测，检测的目的基因为：tet（A） 、tet（B） 、tet（C） 、tet（D） 、tet（G） 、tet（M） 、tet（O） 、tet（
8、S）和 tet（X） 。PCR 反应体系和方法参见文献7。 3 结果与分析 3.1 TR-LFE 中（tet-R）基因阳性菌株的数量统计 采用普通 PCR 技术对选取 TR-LFE 携带的四环素耐药基因进行了检测，得出其分布情况。研究结果：分别统计了 9 月 67 株（GZ：35 株；MZ：32 株） ；11 月 96 株（GZ：32 株；MZ：32 株；TR：32 株） ；1 月 95 株（GZ：31 株；MZ：32株；TR：32 株） 。在检测的 258 株 TR-LFE 中，255 株为 tet-R 基因阳性菌，即至少携带 1 种或 2 种 tet-R 基因，占据检测菌株总数的 74.0
9、3%。从图 1 可以看出，GZ 和 MZ 分离出的菌株含 tet-R 基因的菌株所占的比例明显多于其他样品中的比例，范围在 78.12%96.87%。Andrew Bryan 等8在分离 325 株高耐药性（耐 95g/mL 四环素）的大肠杆菌中检测发现，97%的菌株至少带一种 tet-R 基因。他们检测的 tet-R 基因有 14 种，分别是：tet（A） ，tet（B） ，tet（C） ，tet（D） ，tet（E） ，tet（G） ，tet（K） ，tet（L） ，tet（M） ，tet（O） ，tet（S） ，tetA（P） ，tet（Q）和 tet（X） 。TR 中含 tet-R 基
10、因的菌株在 11 月份和 1 月份的比例分别是25.00%和 46.88%，与猪粪样品相比，其比例降低了近 50%。 由表3 得出，1 月份的 5 个样品中的 TR-LFE 中出现的 tet-R 基因检出的情况与前 2 个月份差异较大。不管是检出频率还是检出的基因数都显著下降。检出基因只有：tet（A） 、tet（B） 、tet（G） 、tet（M） 。与 9 月份的情况相同的是，tet（A）和 tet（B）在 GZ 中有较高的检出率。 综上所述，猪粪的 TR-LFE 中检测到的基因种类最多，有 tet（A） 、tet（B） 、tet（C） 、tet（D） 、tet（M） 、tet（S） 。T
11、R 的 TR-LFE 中出现过 3 种基因，都为 tet（A） 、tet（B）和 tet（G） 。tet（A）在所有样品的 TR-LFE 中都有检测到，检测率最高，tet（B）次之。这与 Al-Bahry SN9和 Roberts10等的研究结果基本吻合；Tao 等 11在研究珠江水样中 tet-R 基因时也发现 tet（A）和 tet（B）广泛分布于珠江分离的大肠杆菌中，而 tet（C）和 tet（D）仅在珠江的几个采样点的菌株中有检测到。类似地，本实验 tet（C）和 tet（D）分别仅出现在 11 月份的 GZ和 9 月份的 MZ 的 TR-LFE 中检测到。tet（G）在 11 月份和
12、 1 月份的 TR中有检测到，未在猪粪样品中检测到。tet（M）主要在猪粪中检测到，几乎每个季度的猪粪中的 TR-LFE 都有检测到。而 tet（S）则仅出现在 9月份和 11 月份的 GZ 中。能编码核糖体保护蛋白的 tet（O）常常由质粒介导，已在一些链球菌和肠球菌中被发现；tet（X）能编码一种氧化还原酶，能在有氧和 NADPH 存在的情况下将四环素灭活9，而本实验所有样品中都没检测到 tet（O）和 tet（X） 。 4 讨论 从养猪场猪粪和土壤中分离的 258 株 TR-LFE 中，共检测到 191 株含有 tet-R 基因，占 74.03%。各样品的乳糖发酵型肠杆菌中 tet-R
13、基因的检出率范围为 3.12%96.87%。根据检出频率的大小，各类 tet-R 基因的排列顺序为：tet（A） ，tet（B） ，tet（M） ，tet（G） ，tet（C） ，tet（D） ，tet（S） 。所有样品的 TR-LFE 中都未检测到编码核糖体保护蛋白的 tet（O）和 tet（X） 。tet（A）和 tet（B）是所有样品中 TR-LFE 中最主要、检出率最大的基因型。 参考文献 1Pruden Amy，Ruoting Pei，Storteboom Heather，et al.Antibiotic Resistance Genes as Emerging Contaminan
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