1、应用 ISSR 和 REMAP 分析吉生羊草体细胞无性系变异摘 要：以吉生羊草成熟种子为试验材料，应用 ISSR 和 REMAP 进行体细胞无性系变异分析。结果表明：愈伤组织诱导培养基有利于羊草愈伤组织的形成，愈伤组织分化率达 80%以上，移栽成活率为 85%以上。以ISSR 和 REMAP 实验数据为基础，分别计算 18 株再生植株及亲本对照之间的遗传相似性系数，表明不同植株彼此间基于 ISSR 的遗传相似性系数范围为 0.9311.000，平均为 0.974。基于 REMAP 分析，所有分析样本彼此间的遗传相似性系数范围为 0.9761.000，平均为 0.996。 关键词：ISSR；RE
2、MAP；羊草；体细胞变异 中图分类号：S54 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20160132006 1 材料和方法 1.1 材料 吉生羊草（Leymus chinensis）成熟种子，采自吉林省乾安县。 1.2 方法 1.2.1 培养基 诱导培养基：MS+300 mg L-1 酸水解酪蛋白+4.0 mg L-12，4-D+3.0%蔗糖+0.7%琼脂；继代培养基：酸水解酪蛋白+2.0 mg L-12，4-D+3.0%蔗糖+0.7%琼脂；再生苗分化培养基：MS+300 mg L-1 酸水解酪蛋白+1.0mg L-12，4-D+0.3 mg L-16-BA+3.0%蔗糖+0.
3、7%琼脂；生根培养基：1/2 MS+1.0mg L-12，4-D+0.1 mg L-1NAA+1%蔗糖+0.7%琼脂（所有培养基 pH 5.8） 。 1.2.2 愈伤组织诱导、继代培养及再生苗分化 将吉生羊草种子去除颖片，用水浸泡约 10h 后，无菌蒸馏水清洗 1次。将种子用 70%乙醇表面消毒 1 分钟，用 0.1%的氯化汞溶液浸泡12min。最后将种子用无菌水冲洗 5 次，接种在愈伤组织诱导培养基上，置于 251条件下暗培养 5 周后，将诱导出的愈伤组织转接到继代培养基上进行继代培养 5 个月后，将胚性愈伤组织转接到再生苗分化培养基上培养，获得再生植株。然后，将高于 3 厘米以上的再生苗转
4、接进行生根壮苗培养。选取根系良好的健壮再生苗，用自来水冲洗、彻底去掉培养基，移栽至无菌土和蛭石（2：1）的混合基质中，于培养室中湿润条件下培养驯化 3 周后移栽至大田。 1.2.3 基因组 DNA 的提取 肉眼观察，吉生羊草再生植株与对照幼苗表型相同。以愈伤组织诱导培养基上一粒吉生羊草种子长出的纤细幼苗为对照，从来源于该粒种子愈伤组织分化的 200 株再生植株中，随机选取 18 株用于 ISSR 和 REMAP分析。 1.2.4 DNA 提取方法 分别采集再生植株和用于对照实验幼苗的幼嫩叶片，提取基因组总DNA，用改良的 CTAB 法1 。 1.3 ISSR 分析 1.3.1 ISSR 引物筛
5、选 利用一套 ISSR 引物（共 52 个引物）检测吉生羊草再生植株基因组变异，分别随机从吉生羊草再生植株 DNA 样本中选取 3 个样本作模板，各自进行 2 个独立重复 PCR 扩增实验。根据 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果，分别从这 52 个引物中选取重复性好、条带清晰、分布均匀的引物进行 PCR 扩增，进一步筛选出分别适合吉生羊草的 ISSR 扩增引物，同时记录条带的分布规律。 1.3.2 ISSR PCR 扩增反应及产物检测 利用所筛选出的引物，分别对 18 株实验材料和对照幼苗的 2 个独立提取批次 DNA 样本进行 ISSR PCR 扩增反应。将 ISSR PCR 扩增产物用
6、2%琼脂糖凝胶在 TAE 缓冲液中进行电泳后，再经溴化乙锭染色，用紫外扫胶仪进行检测、照相。 1.4 REMAP 分析 1.4.1 REMAP 引物筛选 分别以上述 52 个 ISSR 引物作为前引物，利用对应于 BARE-1a （accession Z17327） LTR369-393 核苷酸序列为后引物（该序列 5 端含有一个 EcoR酶切位点）2，作为 REMAP 分析的引物组合。针对每一引物组合，分别随机从吉生羊草再生植株 DNA 样本中选取 3 个样本作模板，各自进行 2 个独立重复 PCR 扩增实验。根据 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果，分别从这 52 个引物组合中选取重复性好
7、、条带清晰、分布均匀的引物进行 PCR 扩增，进一步筛选出分别适合吉生羊草的 REMAP扩增引物组合，同时记录条带的分布规律。 1.4.2 REMAP PCR 扩增反应及产物检测 利用所筛选出的引物组合，分别对 18 株实验材料和对照幼苗的 2 个独立提取批次 DNA 样本进行 REMAP PCR 扩增反应。产物检测分析同ISSR。 1.5 数据分析 仅对与引物组合筛选时结果都一致（2 次独立的实验）的长度为2002000bp 清晰条带进行统计。对于每一材料在同一位点有带则记为“1”，无带则记为“0” ，分别获得吉生羊草亲本及所有再生植株研究样品在所有位点 AFLP“0，1”信息的二维矩阵。
8、应用 NTSYS-PC version 2.10e 软件包分别对上述二维矩阵进行分析，采用 SIMQUAL（Similarity of qualitative data）程序的 Jaccards Similarity Index（JSI）方法产生遗传相似性矩阵，采用非加权配对算术平均法-UPGMA （Unweighted pair-group method，arithmetic average）方法进行聚类分析。 2 结果与分析 2.1 高效的吉生羊草种子诱导愈伤组织和植株再生体系 愈伤组织诱导培养基有利于羊草俞伤组织的形成。当吉生羊草种子在愈伤组织诱导培养基上培养 10d 左右时，在种子及其
9、长出的嫩芽周围开始出现白色半透明、浆糊状愈伤组织，并逐渐长大。继代培养 2 个月后，一半以上的愈伤组织转变为胚性愈伤组织，如他人报道的玉米和大麦胚性愈伤组织结构相似的疏松、亮黄色愈伤组织3。同时，继代培养基也适于胚性愈伤组织状态及其分化潜力的维持。将其转接到合适的分化培养基后，颜色逐渐变淡、质地变硬，其表面开始长出白色或淡紫色的不定根。随后愈伤组织表面出现绿色芽点，逐渐伸出不定芽。通过该再生体系，愈伤组织分化率均可达到 80%以上。移栽成活率可达到 85%以上。 2.2 吉生羊草再生植株遗传不稳定性分析 分别随机从吉生羊草再生植株 DNA 样本中选取 3 个样本作模板，用52 个 ISSR 引
10、物各自进行 2 个独立重复 PCR 扩增实验。结果表明，用其中24 个引物进行扩增反应产生的产物具有高度重复性，可产生不连续带谱，因而被用于 18 株再生植株和对照亲本基因组片段的扩增。关于 ISSR 引物筛选、适宜的退火温度、记录带数、多态性带数及多态性带数比例等详细信息见表 1。每一引物产生 410 条 DNA 片段，平均为 6.04 条 DNA条带。在所筛选的 24 个引物中，相对于亲本对照，其中 17 个引物在所有 18 株再生植株中产生的 ISSR 带谱为单态性，另 7 个引物至少在其中一个再生植株中产生了多态性条带。在所检测的 145 条长度为2002000bp ISSR 条带中，
11、13 条（8.97%）具有多态性，其中 10 条表现为亲本原有条带的缺失，另外 3 条为新产生的 DNA 条带（见图 1） ，缺失的条带数目明显高于新带数目。在 52 个 REMAP 引物组合中，其中 26 个引物组合经 PCR 扩增反应产生了高度重复的带谱。在这 26 个引物组合中，其中 3 个引物组合产生的带谱与 ISSR 所产生的带谱一致。因此，为避免分析结果重复和混乱，选择另外 23 个引物组合用于吉生羊草再生植株的遗传不稳定性分析（见表 2） 。在所用 23 个引物组合中，其中 19 个引物组合经扩增反应后产生了单态性的图谱，而另外 4 个引物组合扩增反应产物中有多态性条带产生。总共
12、记录了 127 条长度范围为 2002000bp的 REMAP 条带，平均每个引物扩增出 5.52 条 DNA 片段。在所记录的条带中，共有 4 条（3.15%）在供试植株中具有多态性，均表现为亲本原有条带的缺失（见图 2） 。 以 ISSR 和 REMAP 实验数据为基础，分别计算 18 株再生植株及亲本对照之间的遗传相似性系数，结果表明不同植株彼此间基于 ISSR 的遗传相似性系数范围为 0.9311.000，平均为 0.974。基于 Jaccard 系数，采用非加权几何平均法（UPGMA）对以上供试植株进行聚类分析，结果表明 19 株植株共聚成 4 组，亲本植物聚在第 3 组（见图 3）
13、 。基于 REMAP 分析，所有分析样本彼此间的遗传相似性系数范围为 0.9761.000，平均为 0.996。从聚类树状图可以看出，再生植株 R6， R8， R13， R14 和R15 变异较明显，没有与亲本幼苗聚在一起（见图 4） 。由此可见，ISSR和 REMAP 2 种分子标记分析结果均表明，组织培养可诱导吉生羊草产生体细胞无性系变异，表明经由种子诱导愈伤、再经分化的再生体系可为优良羊草种质选育提供新的途径。 图 3 基于 ISSR 的吉生羊草再生植株聚类分析树状图 （R1-R18 分别为 18 株再生植株；P 为亲本对照） 图 4 基于 REMAP 的吉生羊草再生植株聚类分析树状图
14、（R1-R18 分别为 18 株再生植株；P 为亲本对照） 3 讨论 吉生羊草为禾本科牧草，具有较强的耐盐碱性。因此吉生羊草高效组培体系的建立具有重要意义。然而，迄今为止关于吉生羊草组培、再生方面的研究报道非常少。根据目前的研究报道，植物幼穗或未成熟胚有利于胚性愈伤组织的诱导，因而许多难于组织培养的禾本科牧草愈伤组织诱导及分化体系多采用幼穗或未成熟胚作为外植体4-7。但幼穗或未成熟胚难于全年供应，取材时期严格受限，从而限制了对应植物组培体系的应用。相比较而言，用成熟种子作为组培外植体，具有取材容易、供应充足等优点。因此，本研究首次以吉生羊草成熟种子为外植体，在愈伤组织诱导培养基中添加适量 2，
15、4-D，建立了简单高效的吉生羊草胚性愈伤组织诱导及植株再生体系。该体系操作简单，其组培苗再生率可达到 80%以上，因而可应用于吉生羊草生物技术育种研究工作。 体外培养通常会对植物细胞造成压力，导致其在外植体接种成活、愈伤组织诱导和植株再生过程中产生突变。据报道，亲本的基因型影响体细胞无性系变异范围和程度7-12。在本研究中，应用 ISSR 和 REMAP 2 种分子标记技术，在 18 株随机选择的吉生羊草再生植株中均检测到了遗传变异。所检测到的变异 DNA 条带，既包括亲本原有条带的缺失，也有新带产生（见图 1） 。同时，为排除外植体杂合性及其他因素对实验结果的影响，本研究严格选用由同一粒吉生
16、羊草种子诱导愈伤、再经分化而来的 18 株再生植株为研究对象，且对 2 个独立批次提取的 DNA 样本进行综合比较分析。由此表明，本研究在吉生羊草再生植株中所检测到的遗传变异，均是在组培过程中真实发生的。 近年来，几种 DNA 分子标记技术已被成功应用于再生植株（包括那些没有明显表型变化的再生植株）体细胞无性系变异分析。在这些分子标记技术中，简单重复序列间扩增（ISSR）具有高敏感性、操作简便及低成本等优点，一直受到研究者的青睐8-10，13。 基于反转录转座子的 REMAP 标记技术，可追踪转座元件的插入，并据此进行遗传传递、发育谱系分析等工作14。目前的报道也表明，在多种植物自然种群遗传多
17、样性研究工作中，REMAP 均比 ISSR 和其他 DNA标记技术更高效。但是，在本研究中，REMAP 在吉生羊草再生植株中仅检测到 3.15%多态性条带。鉴于本研究 REMAP 检测较低的多态性及没有新带出现，表明该组培体系再生压力条件不足以激活转座子及由此诱发体细胞无性系变异。在吉生羊草再生植株中，REMAP 检测到的多态性条带数低于 ISSR 检测结果，较合理的解释是可能因为 ISSR 和 REMAP 引物覆盖的基因区域不同，而这些基因区域在组培条件下发生变异的能力不同15-17。此外，BARE-1 是大麦属植物基因组中较活跃、广泛分布的元件，但其在吉生羊草基因组中的分布情况可能有所不同
18、，可能也是导致本研究 REMAP 检测结果多态性较低的一个原因。 参考文献 1 Kidwell KK， Osborn T C.Simple plant DNA isolation procedures， In Plant genomes： methods for genetic and physical mappingM.J.S.Beckman and T.C.Osborn，eds Dordrecht， The Netherlands： Kluwer Academic Publishers， 1992： 1-13. 2 Kalendar R， Grob T， Regina M， Souniem
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