1、葡萄果醋发酵用醋酸菌的分离与鉴定研究摘要主要采用土壤以及烂化的葡萄皮作为样品，并进行利用增值培养以及定量、定性等培养手段，同时通过首次鉴定及再次鉴定等，从而筛选出一株具有较高醋酸、产量稳定的醋酸菌。 关键词葡萄果醋 醋酸菌 分离 鉴定 1 前言 所谓的葡萄果醋，就是利用葡萄酒或者是葡萄进行产生的残渣皮，同时经过采用现代化生物技术进行酿制，进而形成的一种酸味饮料，该饮料含有独特的风味以及丰富的营养。葡萄果醋同时具备水果与食醋的营养保健作用，以及丰富的维生素和有机酸。能够有效调节血脂，抗氧化等功能。 2 材料准备 首先准备的材料是醋醅，其属于一种无核紫葡萄。其次是菌种，其选择的是活性干酵母 D25
2、4。再次是试剂的准备，有酚酞指示剂、酵母膏、葡萄糖、NaOH 及无水乙醇等。最后就是培养基的准备，有醋酸菌固定培养基及醋酸菌保藏培养基，其中需要的琼脂、酵母膏、葡萄糖、碳酸钙及无水乙醇，分别是2%、1%、1%、2%、6%vol；1.8%、1%、1%、0.5%，6%vol，两中培养基均需自然 pH 值。而醋酸菌液体培养基需要 1%的葡萄糖及酵母膏，6%vol 的无水乙醇，也是自然 pH 值。 3 葡萄果醋发酵用醋酸菌的分离研究 3.1 增殖培养 针对醋酸菌的分离研究，首先采用容量为 20mL 的葡萄醋，该葡萄醋属于自然发酵的，接着放入容量为 250ml 的三角瓶当中，同时再添加容量为 100ml
3、 的基础培养基，之后将其处于 32恒温环境中进行培养，培养时间为两天。通过两天培养之后，进行提取容量为 1ml 的增殖液，并放入无菌蒸馏水当中，该蒸馏水的容量为 9ml，然后进行稀释至三个梯度，分别是 10-5、10-6 及 10-7，在这三个梯度里提取稀释液，每一个梯度均提取 0.2ml。通过采用平板划线的方法与倾注的方法进行接种，并放置于分离培养基当中，给予每个梯度的平板分别三个，放在 32的环境中进行培养，培养时间最长不能超过 3 天，最短不能低于 2 天，最后认真观察。在平板中的稀释液有着不一致的稀释度，所以在进行挑选单菌落时，必须从该平板中进行挑选，才能挑选出形态相同、长势较好以及菌
4、落完整的单菌落。经过单菌落纯化后的菌株，在斜面保藏培养基进行接种，然后通过在 32的环境下进行两天培养之后，保藏在 4的冰箱里。 3.2 醋酸菌定性培养 选取一环活化的菌株，分别在容量为 100ml 的基础培养基里进行培养，此基础培养基中含有 3.0%vol 乙醇，并放在 32恒温环境当中进行静置培养，培养时间为三天。然后通过采用离心机将菌体清除，在一个小烧杯里放入容量为 5ml 的无菌体培养液，再利用浓度为 0.1mol/L 的氢氧化钠溶液进行中和，直到其培养液显示为中性为止。最后滴入 5.0%的FeCl3 溶液，滴入的滴数为 5 滴，观察其变化情况，如果有红褐色的沉淀出现，那么该菌株很大程
5、度上就是醋酸菌。把醋酸菌菌株放在斜面培养基里进行接种，经过在 32环境中进行培养 2 天之后，保存于 4的冰箱中。 3.3 醋酸菌定量培养 选出良好的醋酸菌之后，分别放入醋酸菌液体培养基里进行接种，并在 30的环境下进行 3 天的培养，然后进行测定培养后的醋酸菌的产酸量，通过采用碱式滴定的方法进行测定，其公式为 V V0CNaOH60 L，在这个公式当中，V0 表示的是在选取空白培养基作为对照滴定所用氢氧化钠的体积数，CNaOH 表示的是氢氧化钠的浓度，60 指的是醋酸的分子量，L 表示的是样品的体积。表示样品进行发酵过程中所利用的氢氧化钠的体积数。最后将产酸量比较高的菌株进行筛选出来，同时再
6、进行第二次筛选。 4 葡萄果醋发酵用醋酸菌鉴定分析 4.1 首次鉴定 首先仔细观察菌株接种的形态变化。在平板培养基里进行接种的菌株，通过在 32恒温环境中进行培养两天之后，利用革兰氏染色法将获得的单菌落进行染色，并经过镜检，认真观察其染色的反应变化和形态的基本大小特点。其次进行生理生化实验。进行实验乙醇的过氧化和氧化。最后就是鉴定的一般措施。将待测菌株点种于鉴定培养基的平板当中，每六个菌株点种在一个平板上，培养环境中最低温度是 30，最高温度是 32，培养 315 天后，观察菌体在 3 天、6 天、12 天及 15 天的时间段中的变化情况。若在菌落附近没有透明圈产生，则未能将乙醇氧化，从而未能
7、获取乙酸的菌株。菌落附近有透明圈出现，则表明该菌株能氧化乙醇成乙酸。二醋酸菌的属能需要加深氧化醋酸，让醋酸钙向碳酸钙进行转化，通过培养一定的时间之后，如果在菌落附近出现未透明的乳白色及伴有彩色光泽，这说明在液体基础培养基里存在乙醇氧化。此外，需要注意观察其是否产生无菌膜。 4.2 再次鉴定 菌株通过产酸性试验及革兰氏染色之后，并进行生理化试验。其结果是由于在革兰氏染色的过程中，若没有控制好准确的时间，就会把革兰氏阴性菌逐渐向革兰氏阳性转化，同时短暂的复染时间也会让菌株的形态模糊，在显微镜下难以观察分离的菌株在培养后是否伴有杂菌。但是经过在鉴定培养基平板接种并培养之后，发现有钙圈出现在平板内，则
8、表明阳性的乙酸氧化；然后再接着培养，若有乳白色出现在平板菌落附近，则表明是阳性乙酸氧化；在液体基础培养基上产生菌膜，则表明该产生的菌膜试验是阳性。通过鉴定结果可知，其分离出来的菌种均满足醋酸菌独有的生化特点。 5 总结 总而言之，关于葡萄果醋发酵用醋酸菌的具体分离以及鉴定的分析研究，通过积极采用腐烂的葡萄皮及附近土壤作为主要的样品，并利用各种试验及鉴定方法，从而能够快速获得良好的醋酸菌。 参考文献： 1席青，张德纯，管晓冉.山西醋醅中醋酸菌的分离及初步鉴定J.中国微生态学杂志，2010，3（03）：56-60. 2彭磊，司红丽.酸奶中嗜热链球菌初步分离与鉴定J.现代农业科技， 2011，8（15）：56-60. 3武运，周建中，李凯君，范菊香，董燕，李瑾瑜，杨海燕.葡萄果醋酒精发酵过程工艺的研究J.中国酿造，2010，1（03）：78-80. 4杨颖，刘欠欠，陆胜民，邢建荣，夏其乐.青梅果醋醋酸发酵菌种的筛选与鉴定J.中国食品学报，2010，4（03）：23-30. 5曾利平，王芳.优良果醋醋酸菌的选育J.食品与发酵科技， 2010，6（04）：89-90. 6程世春.柑桔果醋发酵用醋酸菌筛选及特性研究J.四川教育学院学报， 2010，8（06）：12-20.
