1、新型喹啉类Zn2+探针的合成及细胞成像研究匡红波1，王忠龙1，张燕1，徐徐1.2，谷文1.2，王石发1.2 * (1. 南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京 210037；2. 江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏 南京 210037)摘要：以2-甲酰基-8-羟基喹啉为原料，与苯肼进行缩合反应合成了荧光分子探针HSZn，采用FTIR、NMR、HRMS对其结构进行表征。紫外可见光谱和荧光光谱分析研究表明，该探针在水相中对Zn2+具有较好的荧光增强效应，而其他金属离子对其干扰较小；HSZn的荧光强度与Zn2+浓度(1.010-51.010-4mol/L)具有良好的线性关系，检测限低至4.010
2、-8 mol/L；Jobs曲线和LC-MS分析表明，Zn2+与HSZn的络合比为1:2，且探针在pH=513内对Zn2+都有较灵敏的荧光响应。细胞成像实验表明，该探针可在Hela活细胞中实现对Zn2+的荧光成像。关键词: 8-羟基喹啉；希夫碱；锌离子；荧光探针；细胞成像中图分类号：O622.6 文献标识码：A Novel Quinoline-Based Fluorescent Probes for DetectingZn2+ in Living CellsKUANG Hong-bo1, WANG Zhong-long1, ZHANG Yan1, XU Xu1.2, GU Wen1.2, WAN
3、G Shi-fa1.2 *(1 College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China; 2 Key Lab of BiomassEnergy and Material, Jiangsu Province, Nanjing 210042, Jiangsu, China)Abstract: A Schiff-based fluorescent molecular probe (HSZn) was synthesized by condensation ofquinol
4、ine with phenylhydrazine and characterized by FTIR, NMR and HRMS. The UV-Vis spectroscopyand fluorescence spectroscopy studies demonstrated that the probe showed a significant fluorescenceenhancement effect toward Zn2+ in aqueous medium while suffering from a slight interference at thepresence of ot
5、her metal ions. A good linear relationship between the Zn2+ concentrations (1.010-51.010-4mol/L) and the fluorescence intensity was obtained for determining the content of Zn2+ with a detectionlimit of 4.010-8 mol/L. A 1:2 binding ratio of Zn2+/HSZn for the complex was obtained by Jobs plot andLC-MS
6、, HSZn also exhibited a sensitive fluorescence response toward Zn2+ in the wide pH range(pH=513). Cell imaging studies indicated that the probe was capable of detecting endogenous Zn2+ in liveHela cells.Key words: 8-hydroxyquinoline; Schiff-base; zinc ion; fluorescence probe; cell imagingFoundation
7、items: Supported by the Natural National Science Foundation of China (No.31470592); the Major Project of Jiangsu Province University Natural Science (No.14KJ220001); the Open Funding of Jiangsu Key Laboratory of Biomass Energy and Materials (No.JSBEM2014010)基金项目 学基金(No.31470592)；江苏省 学研究重大项目(No.14KJ2
8、20001)；江苏省生物质能源与材料重点实验室 基金项目(No.JSBEM2014010)(1992-)， ， 研究生。 系 (1965-)， ， ， 025-85428369，E-mail 。Zn2+ 为 生活的currency1“，在 生 fi、fl 、内分、生 生程中 ”重的 用。在 的currency1“中，锌currency1 ，1。研究表明，生物 内Zn2+ 生2、 3、fl 系 能 4和 5 。 外， 重的 系 与 Zn2 有关， 6、 金 7和 8 。 ，在生物 内 效 Zn2+对生物学、 学 具有重大。荧光分析 具有 性好、灵敏度 、 单、重现性好、与显镜 用可实现对细胞内外
9、金属离子 时空分辨率成像 优点9-11，设计和合成 效的荧光探针来检测痕currency1金属离子已 成为环境化学和生物学中最重的课题。目前，关锌离子荧光探针的报道 12, 13，其中，希夫碱类荧光感器由具有合成 单、水溶性好、络合金属离子能力强的特点，备受关注 2015年，Roy 14合成了2-(E)-(喹啉-8-亚氨基)甲基羟基喹啉，当化合物溶液中加入Zn2+后，其荧光光谱 生 移，荧光强度显著增强，而加入其他金属离子则没有这 现象；2016年，Sun 15合成了 具有希夫碱结构的Zn2+荧光增强探针，该探针可与Zn2+形成络合比1:1的络合物，其检测限为4.110-8 mol/L；Qin
10、 16合成了 比率型双希夫碱类化合物，能在水相中对Zn2+进行检测，检测限低至8.910-7 mol/L；Yuan 17合成 三唑类希夫碱化合物，通荧光增强效应能 性地检测Zn2+，检测限为5.110-8 mol/L。 8-羟基喹啉 为 乙胺四乙酸(EDTA)的大金属离子螯合剂， 金属离子与其结合后可阻断其分子内激 态质子转移(ESIPT)荧光增强而被广泛应用荧光感分子的设计中18，该类感器的主点是对金属离子 性较差， ，在8-羟基喹啉的2或7引入额外的结合点，增加其对金属离子 的 性，是该类荧光化学感器研究的热点。本文以乙醇为溶剂，在8-羟基喹啉的2进行修饰，合成出 8-羟基喹啉缩苯肼类希夫
11、碱HSZn，并对其光谱性质进行测定，旨在得到 性 、抗干扰能力强的荧光增强型Zn2+探针。合成路线 下示 1 实验部分 1.1 试剂与仪器 用试剂均为市售AR或CP，未 任何处直接使用；金属离子溶液均为相应的硝酸盐或氯盐溶HEPES冲溶液V(无水乙醇):V(水)=4:1中配制而成；Hela细胞成像实验中用生物试剂及耗材由南京凯基生物 技 展有限公司提供。DF-101S型恒温磁力搅拌器(南京 公司)；UV-2450型紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司)；Nicolet 380型 外光谱仪(美 Nicolet公司，KBr压片)；7890A/5975C型气质 用仪(美 Agilent公司)
12、；1200/6310型液质 用仪(美 Agilent公司)；AV 400 MHz核磁 谱仪( Bruker公司)；X-6型显 点测定仪( 京 公司)；QSTAR Elite 分辨液相 质谱仪(美 ABI公司)；LS-55 荧光/ 光分光光度计(美 金 公司)；SW-CJ-1FD型 工 (苏 化公司)；MCO-20AIC型CO2 (日本Sanyo公司)；IX51型生物 显镜(日本Olympus公司)。1.2 目标化合物的合成1.2.1 中间体2的合成: 中 2-甲酰基-8-羟基喹啉 文 19制备， 率74.0%。m.p. 9092 (文 2090 )；IR(KBr), v/ cm-1: 3404
13、 (OH), 2862, 1703 (C=O), 1623, 1588, 1503, 1469, 1331, 1186, 1083, 869, 750；1HNMR (400 MHz,CDCl3), : 10.18 (s, 1H), 8.28 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.02 (d, J = 8.5 Hz,1H), 7.60 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 8.7 Hz, 1H)；13CNMR (100 MHz,CDCl3), : 193.38, 154.38,
14、150.34, 138.24, 137.55, 130.67, 130.58, 117.83, 117.16, 112.66；HRMS (m/z):M-H- calcd for C10H7NO2-H-: 172.0399; found: 172.0404。1.2.2 2-(2-苯基亚肼基甲基)-8-羟基喹啉（HSZn）的合成在配有 、温度计和搅拌磁子的50 mL三 中，加入20 mL无水乙醇和0.32 g (3mmol)苯肼， 分搅拌后，0.34 g (2 mmol)化合物2溶5 mL无水乙醇加入到反应液中，加3乙酸，温至，TLCcurrency1测反应进程。12 h后反应结，“溶剂，得到fi
15、fl ，乙醇重结得到0.3 g ，最 率55.5%。m.p. 220221 ；IR (KBr), v/ cm-1: 3358(OH), 3289 (NH), 3043, 1597 (C=N), 1494, 1431, 1320, 1249, 1159, 1079, 879, 747；1HNMR (400 MHz,DMSO-d6), : 10.92 (s, 1H), 9.60 (s, 1H), 8.23 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.17-8.02 (m, 2H), 7.37 (q, J = 7.9 Hz,2H), 7.28 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 7.19 (
16、d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.08 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 6.84 (t, J = 7.2 Hz, 1H)；13CNMR (100 MHz, CDCl3), : 152.87, 152.13, 143.96, 137.83, 137.33, 136.15, 129.63, 128.08, 127.71,121.31, 118.64, 118.09, 113.36, 110.55；HRMS (m/z): M+H+ calcd for C16H13N3O+H+: 264.1152;found: 264.1131。2 结果与讨论2.1 不同金属离子对化合物HSZn光
17、谱性质的影响1示，未加入金属离子前，HSZn在390 nm处有较的紫外” 。加入Cu2+、Pb2+、La3+、Al3+和Zn2+后，HSZn的” 生了化，特 是加入Zn2+后，化合物在390nm 处 的 ” 明 显 ， ” 光 度 增 ， 而 加 入 其 他 金 属 离 子(Ag+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Fe2+、Fe3+、Hg2+)后HSZn的” 并没有 生化。原 可能是该化合物结构中有-C=N和-OH 具有络合金属能力的基，使得HSZn对Cu2+、Pb2+、La3+、Al3+和Zn2+离子有定的络合 用，进而HSZn的紫外” 曲线 生 。1 加入 金属离子后HSZn的紫外” 光谱F
18、ig. 1 UV absorption spectra of HSZn in 20 mM HEPES buffer solution (V(无水乙醇):V(水)=4:1) upon addition of variousmetal ions (c(HSZn)=1.010-5 mol/L, c(M)=1.010-4 mol/L)为了进研究HSZn对金属离子的 用，了对12 金属离子的荧光响应性(激 为400 nm，430780 nm，Slit EX 5.0 nm，Slit EM 20.0 nm，下 )，结见2。可以 出 ， HSZn (c=1.010-5 mol/L) 的 HEPES 冲 溶 液
19、 中 分 加 入 Ag+ 、Al3+、Cd2+、Co3+、Cr3+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、La3+、Pb2+ (c(M)=1.010-4 mol/L)后，HSZn的荧光强度并没有 生明显化，而加入Zn2+后，HSZn的荧光强度 生了显著增强。 ，化合物HSZn可 为 性检测Zn2+的荧光增强型探针。2 加入 金属离子后HSZn的荧光光谱Fig. 2 Fluorescence emission spectra of HSZn upon addition of various metal ions (c(HSZn)=1.010-5 mol/L,c(M)=1.010-4 mol/L
20、, =400 nm)Inset: The photo of HSZn and HSZn to Zn2+ were taken under UV light (365 nm) 2.2 Zn2+浓度变化对HSZn光谱性质的影响HSZn的特化学结构使其对Zn2+ fl生络合 用。为了进研究 Zn2+浓度对络合 用的响， HSZn的浓度(c=1.010-5 mol/L)，使Zn2+浓度在1.010-51.010-4内化，得到Zn2+浓度下HSZn的紫外” 和荧光光谱，结见3、4。 由3可以出， 系中Zn2+浓度断增加，HSZn的最大” 生了15 nm的 移( 390 nm 移到375 nm)，且其”光
21、度有定增 ；在250 nm处的” 生定程度增强。由 可以出，HSZn与Zn2+ 在良好的络合 用。 3 HSZn的紫外” 光谱Zn2+浓度的化Fig. 3 The change of UV absorption spectra of HSZn in the HEPES buffer solution with increased concentrations ofZn2+ (c(HSZn)=1.010-5 mol/L, c(Zn2+)=11010-5 mol/L) 由4a可 ， 系中Zn2+浓度的断增加，化合物的荧光强度 线性增强。为了得到 系荧光强度 Zn2+浓度的线性关系，600 nm 下
22、的荧光强度进行线性分析，结 4(b)示 合得到线性 程为 y=780.8809x-31.1277, R2=0.9939通 程LOD=3bi/m计 出检测限LOD=4.010-8 mol/L，其中，bi为9 空 的 差，m为线性 程的 率。4 (a) Zn2+离子浓度下HSZn的荧光光谱；(b) 线性关系(600 nm)Fig. 4 (a) Fluorescence emission spectra of HSZn at various concentrations of Zn2+; (b) The linear relationship between Zn2+concentrations a
23、nd fluorescence intensity at 600 nm (c(HSZn)=1.010-5 mol/L, c(Zn2+)=11010-5 mol/L, =400 nm)2.3 HSZn与Zn2+的络合机理为了定HSZn与Zn2+ 的络合比， 文 21 ，HSZn和Zn2+的 浓度 在c=1.010-5 mol/L，物质的currency1比分 为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9， 制出HSZn和Zn2+的络合曲线，结 5(a)示。由 可 ，Zn2+与HSZn的络合比为1:2，质谱M+H+=592.4(5b)的离子验 了 结；对比HSZn及HS
24、Zn和Zn2+络合后的 外光谱(见 )，可以出，HSZn Zn2+络合后，HSZn羟基的 缩 (3358 cm-1)和 双 的 缩 (3289 cm-1) ，且喹啉环 的 双 的 缩 1597 cm-1化到1553 cm-1，这明羟基、双 和喹啉环 的 原子都 与Zn2+的络合； 合以 分析结， 测HSZn与Zn2+的络合 5(c)示。5 (a) HSZn与Zn2+的Jobs曲线；(b) HSZn加Zn2+后的质谱；(c) 络合物的可能结构Fig. 5 (a) Jobs plot of HSZn and Zn2+, the total concentration of HSZn and Zn2
25、+ is 10 mol/L (=400 nm); (b)Mass spectrometry of HSZn to Zn2+ measured by LC-MS; (c) The possible structure of the HSZn-Zn2+2.4 其他金属离子对HSZn检测Zn2+的干扰为了进HSZn和Zn2+的荧光 系受其他金属离子的响， HSZn、Zn2+和其他金属离子物质的currency1比为1:5:10， 加Zn2+和HSZn，后加其他金属离子的 ，测定其荧光强度，激 400 nm，结见6。可以出，Cu2+的加入对 系的荧光强度响最大，荧光 生较大的，其 Pb2+和Cr3+对
26、 系荧光fl生较大响，原 可能是HSZn对这3 金属离子的络合能力比Zn2+强，使分已 和HSZn络合的Zn2+ 系中 离出来， 而 系的荧光 生较大化。当 荧光 系中分 加入Ag+、Al3+、Cd2+、Co2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+和La3+时， 系的荧光强度并没有 生较大的化。以 结表明 Cu2+、Pb2+和Cr3+ 系荧光 生定的，由生物 中这3 金属离子的currency1 低Zn2+，以该探针对检测生物 内的Zn2+ 受到其他金属离子的干扰。6 其他金属离子对HSZn检测Zn2+的干扰Fig. 6 Fluorescence responses of HSZn detect Z
27、n2+ in the presence of other metal ions (c(HSZn)=1.010-5 mol/L,c(Zn2+)=5.010-5 mol/L, c(M)=1010-5 mol/L, =400 nm)2.5 不同pH对体系荧光强度的影响HSZn分子结构中有-C=N和-OH活性基，以溶剂的pH对 系的荧光强度 有定的响。在 pH的乙醇溶液中了 系荧光强度pH的化，荧光 系中HSZn和Zn2+浓度分为110-5和110-4 mol/L，结见7。可以出，当溶液pH=3时， 系的荧光 生完全，原 是HSZn中的-C=N在酸性较强的条件下 生分解，使HSZn丧 了络合Zn2+的
28、能力；当溶液pH=5时，相对中性条件，荧光曲线 生 移；而当溶液pH=9时，荧光曲线却 生 移；pH的继续增大， 系荧光强度继续增大。结表明 HSZn与Zn2+络合 系的荧光强度与 系的pH有关，酸性较强时HSZn 生分解，使HSZn丧 络合Zn2+的能力；酸性较低时，化合物中的 原子 生质子化， 金属离子络合，其荧光强度降低；而在碱性条件下，HSZn中原子 的孤对 子比较活泼，更 给出 子，以， 系中的pH越大，荧光强度越强。 ，探针在pH=513内对Zn2+都有较灵敏的荧光响应。 7 pH的乙醇溶液对HSZn和Zn2+荧光 系的响Fig. 7 Fluorescence intensity
29、of HSZn in the presence of Zn2+ in ethanol solution with different pH values(c(HSZn)=1.010-5 mol/L, c(Zn2+)=1.010-4 mol/L, =400 nm)2.6 细胞毒性和荧光显微成像实验细胞毒性是探针HSZn能否应用生物 记的重指 。采用MTT 对 肝细胞(LO2)进行细胞毒性测试，结 表1示。LO2细胞 浓度的HSZn处24 h后，在6.250-200 mol/L内，HSZn对LO2都表现出无毒和低毒的性能。 ，HSZn能够进用对Zn2+的荧光成像实验。表1 浓度HSZn对 肝细胞
30、活率的响Table1 Effect of different concentrations of HSZn on cell viabilityHSZn浓度/(mol/L) OD (”光度) 细胞 活率/%6.250 0.5800.003 95.60012.500 0.5840.034 95.60025 0.6120.017 99.00050 0.6070.017 99.840100 0.5860.012 99.270200 0.5860.015 94.620对 0.6130.011 100取对生期的细胞， 胰酶 化后，用 液调整细胞浓度， 每孔510 5细胞的currency1接 六孔板中，3
31、7 ， 积分5 % CO2及饱和湿度条件下孵fi12 h；待细胞贴壁生后，移 液，用PBS清洗两 。每孔加入用 基稀释的HSZn (最 用浓度510-5 mol/L)，继续孵fi30min后；六孔板 荧光显镜的载物 ，定观区及层面后，分 采集荧光像(8a)和明场下像(8b)。由8b可以出， HSZn处后并响Hela细胞的 生；在六孔板中加入配好的Zn2+(最 用浓度510-4 mol/L)， 用15 min后，六孔板 荧光显镜的载物 ，定 观区及层面后，采集荧光像(8c)， 3张片可以出，HSZn和Zn2+处后的Hela细胞清晰可见。实验结表明，该探针具有良好的细胞渗透性，可成 实现对Hela
32、细胞内Zn2+的荧光成像。8 HSZn在Hela细胞中对Zn2+的成像分析Fig. 8 Fluorescence images of Zn2+ in Hela cells with HSZn(a) Fluorescence image of Hela cells treated with HSZn; (b) Bright-field image of cells; (c) Fluorescence image in thepresence of Zn2+ (c(HSZn)=5.010-5 mol/L, c(Zn2+)=5.010-4 mol/L, =400 nm)3 结论以2-甲酰基-8-羟基
33、喹啉为原料，与苯肼进行缩合反应合成了荧光增强型探针HSZn，该探针在水相中对Zn2+具有良好的 性且 受其他见金属离子干扰；在1.010-5-1.010-4 mol/L内可实现对Zn2+的定currency1检测；Jobs曲线和LC-MS分析 明，Zn2+与HSZn的络合比为1:2，且探针HSZn在pH=513内对Zn2+都有较灵敏的荧光响应；细胞毒性和细胞荧光成像实验结表明，该探针可用Hela活细胞中Zn2+荧光 记， ，有望其应用生物 内锌离子的检测。文 1Yang Pin (杨频), Gao Fei ( 飞). Principles of biological inorganic che
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