1、毕业论文 - 1 -石蜡组织切片法摘要；石蜡切片（paraffin section）是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。关键词：石蜡组织切片、制作法引言 石蜡组织切片制作广泛应用形态学实验教学用片及医院病理检查切片制作过程中，而在
2、制作石蜡组织切片标本，必须把握制作中的每个环节。石蜡组织切片广泛应用于形态学实验教学及活组织病理检查中。随着现代科技的发展，人们对疾病的诊断和治疗越早越好，即“早发现,早诊断、早治疗、早预防” 。而形态学（如组织胚胎学，病理学）研究的是人体在正常或异常情况下的微细结构，要更好的掌握这些镜下结构，只有多看组织切片。由此可见，组织切片在形态学实验教学及外活组织病理检查中的重要性 1,2。石蜡组织切片在制作使相当繁琐，是一项技术要求很严格的工作。具体过程如下：取材固定冲洗脱水包埋切片烤片脱蜡染色脱水透明封片等一系列过程。石蜡切片一直是组织学，病理组织学和法医病理学等生物医学的最基本和最普通形态学检验
3、技术 3。1 制片过程1.1 取材毕业论文 - 2 -取材作为石蜡组织切片制作的第一道步骤，对将来成片的结果起着举足轻重的作用。取材的好坏直接关系到石蜡组织切片质量的好坏。在制作形态学石蜡组织切片时，有的制作者往往有一个错误的概念，即必须将取材对象规定为人体各器官组织，其实这是不正确的。主要是因为人体取材比较麻烦，人体比较匮乏，其他哺乳动物（如家兔、猪、羊等）有与人体共同的特点，也就是哺乳动物的共同特点：即全身有体毛，以乳汁哺育后代，体腔被膈分为上胸下腹，有左右对称的身体等。而且有的哺乳动物组织器官的结构比人体的还要典型，比如说猪肝小叶的组织结构比人肝小叶的组织结构更典型，猪肝小叶分界清晰，肛
4、门管区内的小叶间动脉，小叶间胆管结构清楚，分界更清晰，比人肝小叶肛门管区的结构更典型 4。所以在使用正常形态学实验教学时选用一些其他动物的切片进行教学，效果会更好，学生接受起来更容易，当然在病理活组织检查及异常人体组切片观察时要除外。在制作形态学组织切片时，有的制作者往往对取材的时间不予重视，这样容易影响切片效果。取材一定要新鲜，即迅速宰杀的动物的相应部位（如肝脏、胃、血管等）提取组织，如果动物死亡时间过长，脏器的细胞构成，蛋白就会变性坏死，这样制作的组织切片效果就不好。同样，在外科手术切除脏器做病检时，也应迅速在患者的切除部位提取组织，经处理后制作成切片，如果过一段时间后再取材制片，就会使病
5、检工作加大难度，从而影响疾病诊断的结果。取材部位一定要选合适，比如说在制作肾实质时，所选部位一定由外向内，而不应在里面选一部分，如果只选里面部分，做出来的切片效果就不能反映肾脏的被摸皮质髓质的结构；再如在做临床活组织病理检查制片时，假如医生给一位患者做胃镜检查时，怀疑患有胃癌，那么医生必须要在怀疑病变的部位取一些活组织制成石蜡切片进行检查，而不是随随便便在该患者胃部的任何一个部位取一些活组织来制片，否则制出的切片就没有任何代表性，对疾病的诊断也没有意义。有些制做者在取材后往往会忽略取材后的问题，比如说有的制作者已下班或有其他事情，往往会把取材标本闲置一旁，而没有马上放到固定试剂中予以固定。这样
6、一来，取材标本里的蛋白就会变性，细胞成分也会发生改变，制作出来的切片往往会发生改变。正确的方式是取材后应马上将标本放入 4的多毕业论文 - 3 -聚甲醛中予以固定 1224 小时，然后再进行处理。另外有的器官在取材后应予以冲洗，比如有的沾有尘土和杂物，有的出血比较严重，应冲洗干净，否则就会影响制片效果。由上几点不难看出，取材对形态学石蜡组织切片制作的重要性，把握好取材这一关，就会使切片制作有一个良好的开端。俗话说：良好的开端就是成功的一半。如果制作者在制作切片取材时作好以上四点，使取材这一关得到保证，就一定会制作出高质量的形态学石蜡组织切片。1.2 固定组织切片的固定剂主要为甲醛和酒精，固定剂
7、可与蛋白质交联结合，使之变性，组织硬化，结构固定，此外其本身的变性物质可与染料结合，增强着色能力。同时，固定交联和沉淀蛋白质、脂肪、糖、酶等细胞内物质成分，产生不同的折光率，使得光学显微镜下易于更清晰地观察组织细胞的微细结构。在诸多影响切片质量的因素中，尤以固定较为重要。减少或去除组织切片中甲醛颗粒甲醛饱和液偏酸，影响细胞核的染色，特别是放置较久后，易析出沉积在组织切片中，呈细小的黑褐色或黑色颗粒物，影响观察。以甲醛饱和液和 pH7.2的 PBS 缓冲液配置的10中性甲醛固定液（体积比为 1：9）应用最普遍，效果也相对较好，可以减少和消除甲醛颗粒。如果现场无法配制 PBS 缓冲液，可以在固定溶
8、液中加入一些普通白粉笔，使溶液呈中性或弱碱性。甲醛颗粒易于出现在血液和血浆分布区，以及自然腐败较重的组织，可作为组织出血和血浆渗出指示剂。防止组织固定不良固定液过浓或过稀释，渗透组织的能力就差，组织固定不均匀，出现中央区组织固定不良。不仅取材时，组织软硬不均，切片不平整，影响切片时修平组织观察面，组织不良会影响脱水、浸蜡、染色等效果。一般固定液与检材体积比为 1：10 左右为宜，器官组织完全浸泡于固定液中，固定时间 37d。自溶腐败严重组织检材固定时间应适当延长几天，或增加固定液中甲醛浓度（可按1：8 比例配制） 。环境寒冷时，亦应适当增加固定液浓度。固定液每天浸透组织约 23，为快速完全固定
9、组织检材，脑、肝、肺、毕业论文 - 4 -心、肾、脾等较大器官，均应切开后再固定。全脑应线绳悬吊固定（普通病理检验，先正中切开后固定） ，新应常规切开各房室腔，肺和肾应分别从最大外缘向肺门和肾门正中切一刀，肝，脾常规平行长轴切然后固定。如果固定的器官较大，容器较小是，应于固定 3d 内翻动器官或更换固定液，以免大器官贴壁面压平或固定不良。1.3 冲洗固定好的组织块需经流水冲洗 24h，冲洗不彻底容易造成脱片和染色不佳。对需做免疫组织化学的组织，更不能疏忽这一步。1.4 脱水脱水是影响切片制作的重要环节，要保证脱水的彻底而又不过度。首先要保证剃度酒精实际的浓度、容量，要及时更换。脱水不彻底导致透
10、明时无法置换组织中水分，浸蜡不完全，切片时组织中间出现松软空洞，摊片时切片容易散开，染色时易于脱片、着色不良，蜡块缩水。脱水时要根据不同的组织、大小、年龄，以及动物的标本，调整各步时间。由于丙酮易挥发，要经常更换，以保持浓度。脱水过度组织块变硬，切片时易于碎裂。脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于有机溶剂的渗入。1.5 透明脱水是否彻底，直接关系到组织能否充分透明。脱水一般采取上行剃度酒精，从 80酒精、95酒精至无水酒精。还要注意组织在无水酒精内时间过久，容易发脆，一般约为 4h。组织块脱水后就就进入透明步骤，即经过一种既能与脱水剂混合，又能与石蜡相溶的媒介物质。目前最好的透明剂
11、是二甲苯，但二甲苯容易使组织发脆，所以在二甲苯中时间也不宜过长，一般 4060min。1.6 浸蜡组织透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡。浸蜡温度过高（超过 70），就导致组织发硬，还会使组织内的抗原受到破坏。浸蜡用的石蜡熔点一般在5660，浸蜡温度控制在 6070。浸蜡时间的长短直接影响组织切片，不同的组织浸蜡时间不同，通常较脆组织如肝、甲状腺、脾等浸蜡 23h 含有结缔组织的器官如胃、膀胱、肠等浸蜡时间要延长 6h。所用的石蜡如有杂质尽可能过滤，以防附着在组织上，影响切片与观察。毕业论文 - 5 -1.7 包埋用包埋剂来支持组织的过程称为包埋。最常用的是石蜡包埋法。包埋的关键是平整和
12、方位。包埋时，要求用镊子轻压组织块拱起部分，使之平贴与底部，通常采用组织的最大面包埋；囊壁、管腔组织应竖直包埋。修去两边的余蜡。（指切片时与切片垂直的两侧） 。包埋的石蜡应预先溶解一段时间，以保证石蜡密度均匀，初熔石蜡中含有杂质，应去除沉淀或絮状杂质，保证石蜡干净、致密，利于切片。应根据不同的季节调整包埋蜡的熔点，冬季用 6062高熔点蜡。包埋时蜡缸温度不超过 70，防止石蜡挥发，污染环境。1.8 切片切片的第一步需粗切，再进行细切。切片时要求用力均匀、柔和。切下的蜡膜大小、形状应与组织块上的组织大小形状一致。如气温较高，石蜡组织块较软可用冰块局部冰冻，使组织块变硬便于做连续性切片；如气温较底
13、、石蜡组织块较硬使可用大拇指热敷或用嘴吹气家温，使组织块变软再做连续性切片。环境温度高时，切片前可将蜡块放入冰箱冷藏柜预冷 30min。刚包埋好的热蜡块不能立刻冷冻，速冷会造成蜡块裂痕，组织块易碎。在刀架上放置组织蜡块时，应注意组织块包埋方向、组织层次等，以减少组织断裂现象。操作切片机时应用力均匀，避免用力过重。脱钙的组织、骨髓，以及钙化组织，应选用固定刀口，以减少刀刃过多的缺口。用毛笔展片时，要防止笔丝进入刀口，以免增加刀刃缺口。为了减少刀片损耗，修片是用已经旧刀片，切片时用用新刀片，保持新刀片刃锋利、不粘蜡，避免切片皱褶和刀痕、易碎，应及时更换刀口位置或刀片。蜡块夹不紧或刀片边钝时，易跳刀
14、，应重新调整夹板或更换刀片。切片时，动作要轻柔，用力均匀，避免切片厚薄不均。每切一个蜡块都应该把切片刀和刀架的碎片都清理干净，避免组织间的相互污染。如遇难切的蜡片时，可用与蜡块切面大小相仿的薄纸潮湿后贴蜡块表面上切片，然后将附有切片一面朝上放入水中漂片。切片不完整、皱缩或卷片，可能刀不快或切片角度不对，一旦调准最佳切片角度和魔刀角度不要随意改变。1.9 摊片毕业论文 - 6 -摊片的水温一般为 4045。摊片时动作要匀速轻柔，避免皱褶和产生气泡。水温过高，切片易离散。出现小气泡时，可用眼科镊尖端在水下小心地移除气泡，以减少脱片和组织破损的机会。室温低时，捞片时将灾玻片放入水中片刻，防止切片褶皱
15、而导致脱片。1.10 烤片烤片温度应为 70左右，烤片时间不少于 30min。温度过高和时间过长，组织易干固、皱缩，折光增强。1.11 染色按常规的 HE 染色。染色理想的切片在显微镜下应是细胞核与细胞质蓝红相映，色泽鲜艳，核浆对比明显，核膜及核染色质颗粒清晰可见。染色过程中，首先应保证各种试剂的浓度、体积，不能有沉淀。用 Harris苏木精液时，染色前要先用一张滤纸除去液体表面的结晶，以免污染切片。脱蜡彻底，不然易出现嗜碱性片状模糊，毛玻璃样现象，染色不均。严格控制酒精剃度时间，以免水分过快进入细胞，破坏细胞结构，影响染色效果。染色时调节 PH 值很重要，在甲醛溶液中固定时间长的组织块，组织
16、酸化而影响细胞核着色，固应自来水冲洗时间长一些或在稀氨水中处理 12min，以使细胞核着色较深。胞浆伊红着色不佳时，可在伊红溶液中滴加 12 滴冰醋酸。脱蜡之后，在无水乙醇中时间要足够长，以完全洗去二甲苯。严格控制分化时间，最好在显微镜下观察分化效果，一般以细胞核染色清晰而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色 5。盐酸酒精分化之后冲水时间不少于 5min，尽可能洗去胞质中苏木素染液，增强返蓝效果，使背景不遗留过多染色。染色过程中不要让切片干枯，以免切片收缩、变形，影响细胞形态。切片经酒精脱水后，入二甲苯时出现白色不透明状态，脱水不彻底，应更换酒精、二甲苯
17、，将切片退回无水酒精，重新彻底脱水与透明。透明完全的切片显得干净、透亮便于观察。常规组织切片染色制作中常见问题及其解决方法序 异常现象 可能的原因 解决方法毕业论文 - 7 -号1 组织细胞弥漫均匀溶解，多见气泡和液气泡自溶、腐败 死后 48 小时内尸检或尽早冷冻尸体（一般不超过一周）2 整个器官中间组织瘫软、溶解，筛网状固定不佳，固定液浓度或相对容量不足各器官最大面切开后放入510 倍体积的标准浓度固定液3 组织多量细小黑褐色或黄褐色颗粒甲醛结晶颗粒 配置 PBS 中性甲醛固定液，或中性多聚甲醛固定液4 盖波片上不规则结晶 洗片不净 洗液、肥皂浸泡、蒸馏水漂洗，微波漂洗5 大小不一、边缘规则
18、的腔隙冷冻尸体组织的冰晶避免过低温度和过长时间冰冻尸体或组织6 不规则、大小不一、边缘渐薄的腔隙组织周缩、包埋不平，切面修块不平组织固定完全，组织观察面切取平整7 组织蜡块切面短时间内干固皱缩凹陷脱水不佳 更换剃度酒精试剂，调整脱水时间8 组织着色不均、中央区淡染脱水不佳，切片厚薄不均更换剃度酒精脱水液，均匀切片厚度9 切片时组织易碎，组织细小碎裂包埋蜡过硬，蜡块温度底，刀钝根据环境温度调整石蜡熔点，不需冷冻蜡块，换刀10 组织不规则碎裂、固缩、折光脱水透明过度 降低剃度酒精浓度、减少脱水、透明时间11 脱片 脱水不全，玻片不洁，切片太厚，烤片不充分洗净载玻片，脱水彻底，均匀切片，烤片时间和温
19、度充分，捞片避免气泡12 组织中央区嗜碱性片状毛玻璃样模糊脱蜡不全 更换二甲苯或增加脱蜡时间13 横行大片“垄沟”状 刀钝 精磨切刀或更换刀片，移动毕业论文 - 8 -平行皱褶 切片刀口14 纵行皱褶和/或组织堆积刀刃粘蜡 切片时及时擦拭刀面上粘附的蜡迹15 横行宽大的组织厚薄不均跳刀、刀钝 夹紧蜡块或刀片，移动切片刀口16 纵行齐边的裂痕 刀刃豁口 更换刀片，移动切片刀口17 组织干固皱缩、组织焦化、折光强浸蜡或烤片温度过高、时间过长调整浸蜡温度烤片温度75、时间短于 12 小时18 核染色模糊不清、噬伊红色过强苏木素过期，分化过头，返蓝不好更换苏木素液，缩短伊红分化时间，弱碱液返蓝或延长冲
20、水时间19 组织嗜碱性强过蓝、伊红色淡苏木素浸染时间过长，伊红过期，分化不足更换伊红液，延长分化时间20 组织碎片重叠、杂质污染（嗜酸性）伊红染液、杂质多 过滤伊红染液21 组织碎片重叠、杂质污染（嗜碱性）苏木素染液、杂质多过滤苏木素染液22 组织碎片重叠、杂质污染（同色）摊片水陈旧、杂质多，染色时污染过滤或更换摊片机水，过滤各缸液体23 切片组织分散、疏松 摊展片水过热、时间过长控制水温在 4143，组织展开后及时捞片24 组织有空洞（镜下可见）修片后未调节修片厚度修片后切掉刚开始几张25 组织内圆形裂 铺片气泡暴烈 避免摊片时产生气泡26 组织折叠 摊片水温低，展片不好调高摊片水温27 不
21、规则脱片缺失，组织皱褶和反折脱水、烤片、摊片不良，玻片不洁载玻片干净、脱水彻底、烤片充分，避免捞片气泡毕业论文 - 9 -28 切片边缘或组织裂隙中伊红浆液样物质载玻片不洁、粘片物质残留清洁玻片，擦拭干净粘片物质29 折光不均 封片树脂胶浓稠、扩散厚薄不均加入适量二甲苯稀释树脂胶30 小气泡 树脂胶稠，二甲苯挥发，封片手法错误重新调配树胶，封片时应将盖玻片从一侧小心放下31 大气泡 树脂胶稀薄，封片手法错误调配树脂胶浓度，树脂胶由中央向周边扩散32 溢胶 树脂胶稀薄、过多 封片树胶浓度、量适中33 切片褪色 染液过期，分化时间长，返蓝不彻底，切片日光或强光晒更换染液，控制分化时间、返蓝程度，切
22、片避光保存注：横行指与切片时刀刃缘平行的组织面边缘方向；纵行指与切片时刀刃缘垂直的组织面边缘方向。1.12 脱水切片脱水采用上行剃度酒精。浓度低的酒精比浓度高的酒精更容易脱水，但也容易使伊红褪色，固脱水时间要短（12min） ，也可无须用酒精脱水而直接晾干。切片经二甲苯透明。用中性树胶封片，一定要避免气泡的产生。1.13 封片二甲苯透明后，迅速擦去材料周围多余液体，滴加适量（12 滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡，封片后即制成永久性玻片标本，在光镜下可长期反复观察。注意有些染料需特定厂家生产的产品。根据各种染色方法、组织类别及切片厚度，掌握适宜的染色时间，才能达到较好的染色效
23、果。 2 石蜡切片与其他技术方法的结合 石蜡切片虽然是经典的方法，但又是最基本的方法，它与其他新的技术方法相结合，使传统的老技术扩大了其应用范围，开辟了许多新领域，增加了许多新的研究、观察内容。随新的仪器及新的研究技术的不断问世及使用，使组织学的观察研究从简单的形态结构深入到各种成分的定性观察，又从定性转向定量毕业论文 - 10 -计测，使细胞组织的形态，功能及代谢三结合，从而达到定性可靠、定位准确及定量可测。2.1 与免疫学技术结合 组织制片技术与免疫学技术结合构成免疫组织（细胞）化学技术，利用抗原与抗体的特异性结合原理，检测组织切片中细胞组织的多肽及蛋白质等大分子物质的定性和定位观察研究。
24、不论哪种免疫组织化学技术都包括抗体的制备、组织材料处理、制备玻片标本以及免疫染色。冰冻切片手续简便，制片过程中抗原活性丢失少，但组织细胞形态较差；石蜡切片步骤繁多，制片中抗原活性有所减低，但组织细胞形态清晰，是免疫组织化学常规制备切片方法之一。一般石蜡包埋的组织切片用于检测胞浆或核内的抗原，不宜做表面抗原染色，有人将新鲜组织浸泡于冷磷酸缓冲液内 48 小时，再固定于96乙醇或其他固定液固定的组织切片，可用于表面抗原染色。乙醇、丙酮等固定剂对抗原破坏较轻，但结构保存较差。最常用的固定液有中性和缓冲福尔马林，它可与蛋白质交叉结合封闭抗原，在进行免疫染色前，切片再用蛋白酶消化，以暴露抗原部位、增强抗
25、原的反应。在石蜡切片上进行的常用的免疫组化染色有免疫酶组织化学技术中的 PAP 法（非标记过氧化物酶-抗过氧化物酶法）及亲和免疫组织化学技术中的 ABC 法（抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物技术），其特异性强、敏感性高。使用两种染色法的组织切片都需先经第一抗体（各种抗血清）孵育；再经第二抗体或生物素标记的第二抗体孵育；后经 PAP复和物或 ABC 复合物孵育，最后以 DAB（二氨基联苯胺）-H2O2 液显色呈棕黄色沉淀。常规复染、脱水、透明、封片成永久性玻片标本，光镜下检测常规或特殊染色法难以显示的成分及其精确定位，可用于基础研究及临床病理研究及诊断。微波用于石蜡包埋切片免疫组织化学染色既简化步骤又节省时间，且能促进免疫染色效果 6。2.2 石蜡包埋组织流式细胞仪 DNA 含量分析 是石蜡包埋组织切片与流式细胞术（flow cytometry，FCM）结合使用来测量 DNA 含量及倍体分析，这一结合是流式细胞仪在临床应用中，特别是在肿瘤研究方面开拓了新的研究途径。FCM 是激光、电子和电子计算机、流体喷射技术的综合发展应用，是快速定量分析细胞的技术，要求被检细胞呈悬浮状态。目前已可测量细胞的大小、体积、DNA含量、DNA 合成速率、RNA 含量、表面抗原、染色体等。由于制备样品技术的原
